[發明專利]一種結核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200810201635.2
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101760518A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 沈維祥;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種結核分支桿菌活菌檢測方法，其特征在于，它具有快速、高質量提取RNA的方法和檢測試劑盒。

2.根據權利要求1所述的RNA提取方法，其操作步驟包括：

①在痰液標本中加入2倍體積的4％NaOH溶液(自備)，吹打均勻后室溫放置30分鐘使之液化。取約1ml液化痰液，15,000rpm離心10min，吸棄上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋渦振蕩10sec，15，000rpm離心10min，吸棄上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋渦振蕩10sec，15,000rpm離心10min，吸棄上清，保留5μl左右沉淀。

②在沉淀中加入0.5ml?Trizol試劑，旋渦振蕩10sec，室溫放置5min。

③加入0.1ml氯仿，振蕩混勻充分乳化、不分層，4℃15,000rmp離心10min。吸取上清到另一無RNA酶的1.5ml離子管。

④加入等體積的異丙醇，振蕩混勻后室溫放置10min，4℃15,000rmp離心10min后小心棄去上清。

⑤加入75％冰乙醇500μl，振蕩懸起沉淀后于4℃、15,000rmp離心10min，小心棄去上清。干燥5～10min后使乙醇揮發。

⑥沉淀中加入10μl?DNase?I處理緩沖液(1μl?10×DNase?I?Buffer、2U的DNase?I(RNase-free)和DEPC水)，室溫(37℃)孵育15min后；加入1μl的20mM?EDTA(RNase-free)，70℃放置5min，4℃13,000rmp離心1min即可進行RT-PCR，或-70℃保存1周左右。

3.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，它具有特異性引物和探針，包括如下序列：

上游引物SEQ?ID?NO1：5’-CGC?GCC?CAA?GAC?GAC?TAC?A??-3’

下游引物SEQ?ID?NO2：5’-AGG?CCG?GGC?TGT?ACC?AGT-3’

檢測探針SEQ?ID?NO3：5’-MAR-TCG?GCG?GGC?AGT?CCA?GCTTCT-MAR-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；

或者與上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的堿基互補序列；

或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。

4.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，其組成包括：細胞裂解液、水、含有權利要求3所述引物序列SEQ?ID?NO1-2的RT-PCR反應液、含有權利要求3所述探針序列SEQ?ID?NO3的檢測探針、逆轉錄酶、DNA聚合酶、參考品、陽性對照和陰性對照。

5.根據權利要求4所述的檢測試劑盒的組成，其特征在于，所說的參考品為如下DNA序列SEQ?ID?NO4：

5’-CGCGCCCAAG?ACGACTACAA?CGGCTGGGAT?ATCAACACCCCGGCGTTCGA?GTGGTACTAC?CAGTCGGGAC?TGTCGATAGTCATGCCGGTC?GGCGGGCAGT?CCAGCTTCTA?CAGCGACTGGTACAGCCCGG?CCT-3’。

6.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所說的水為無RNA酶的水。

7.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所說的陰性對照為無結核分支桿菌活菌的正常人痰液樣本。

8.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所說的陽性對照為含有結核分支桿菌活菌的患者痰液樣本。

9.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所說的細胞裂解液由細胞裂解液I和細胞裂解液II組成。

10.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，每盒中各組分的量為：細胞裂解液I?1瓶24mL、細胞裂解液II?1瓶6mL、無RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反應液1管210μL、檢測探針1管30μL、參考品1管10μL、和陰性對照品1管10μL。