[發明專利]一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法

無效

• 申請號: 200810200344.1
• 申請日: 2008-09-23
• 公開（公告）號: CN101386868A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 劉建平;李育陽;俞靜;袁漢英;蔡顯鵬
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N9/24;C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高重組蛋白表達水平的技術方案。

背景技術

酵母是一類單細胞的低等真核生物，兼有原核和真核細胞的特點：既培養方便，繁殖快，成本低，易于基因操作，又具有分泌途徑，可對真核基因產物進行翻譯后加工修飾，得到正確折疊、有活性的蛋白質。因此酵母表達系統被譽為最有商業價值的表達系統(F.R.Schmidt，Recombinant?expression?systems?in?thepharmaceutical?industry，Appl?Microbiol?Biotechnol，65:363-372，2004)。除應用廣泛的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達系統外，還存在一類以克魯維酵母(Kluyveromyces)為代表的非常規酵母表達系統。

克魯維酵母主要包括乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces?lactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces?fragilis)、馬科斯克魯維酵母(Kluyveromyces?marxianus)等種類，其中乳酸克魯維酵母是一種能夠以乳酸作為唯一炭源生長的酵母，具有營養要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣(25℃-46℃)、分泌蛋白能力強，對人類安全(GRAS，Generally?Regarded?as?Safe)等特點，是一種較理想的重組蛋白表達宿主細胞，迄今已建立了適于外源基因表達的較完善的乳酸克魯維酵母表達系統，利用該系統人們已成功表達了人血清白蛋白、α-半乳糖苷酶、牛凝乳酶等多種重組蛋白(Albert?J.J.van?Ooyen?et?al，Heterologousprotein?production?in?the?yeast?Kluyveromyces?lactis，FEMS?Yeast?Res?6:381-392，2006)。

釀酒酵母HAP1基因(ScHAP1)編碼一種轉錄因子，調控一些細胞呼吸代謝途徑必需基因的轉錄表達(Pfeifer，K.，Kim，K.S.，Kogan，S.and?Guarente，L.1989.Functional?dissection?and?sequence?of?yeast?HAPI?activator.Cell.56：291-301)。作為ScHAP1同源基因，乳酸克魯維酵母HAP1基因(K1HAP1)的功能目前尚不清楚。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達水平的新方法。

本發明提供了一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法，該方法包括如下步驟：

(1)將菊粉酶基因的啟動子、α-信號肽、目的蛋白和菊粉酶基因的終止子編碼序列依次連接；(菊粉酶基因的啟動子和終止子序列見GenBank登入號：AF178979；α-信號肽的GenBank登入號：J01340)

(2)將(1)得到的序列插入克魯維酵母表達載體pUKD-S或者pUKD；

(3)用(2)獲得的重組載體轉化克魯維酵母，發酵，取發酵上清液分離即可。

本發明中，(3)中采用的克魯維酵母可以是乳酸克魯維酵母、鷹嘴豆克魯維酵母、馬科斯克魯維酵母或者脆壁克魯維酵母。

本發明中，所用的乳酸克魯維酵母可以是MW179-1D?HAP1基因缺陷菌株。乳酸克魯維菌株MW179-1D信息見文獻：Imrichova?D?et?al.YAP1-mediatedKNQ1?expression?in?Kluyveromyces?lactis，FEMS?Yeast?Research，5(4-5)：323-329，2005。

本發明中，(1)中啟動子可以是通過以鷹嘴豆克魯維酵母Y179(出處見Zhang?J?et?al.Cloning?of?the?Kc?URA3?Gene?and?Development?of?aTransformation?System?for?Kluyveromyces?cicerisporus，Appl?MicrobiolBiotechnol.，62(4):387-391，.2003.)的總DNA為模板，以P1和P2為引物，PCR擴增獲得的；P1的序列如SEQ?ID?NO?2所示，P2的序列如SEQ?ID?NO?3所示。