[發明專利]用于古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物

無效

• 申請號: 200810200280.5
• 申請日: 2008-09-24
• 公開（公告）號: CN101368214A
• 公開（公告）日: 2009-02-18
• 發明（設計）人: 宋任濤;濮佳;胡啟雯;賀其其;李莉;馬中良;許政暟
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海上大專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及一對用于PCR的引物。特別是一對用于古細菌多樣性分析的針對16S?rRNA基因的引物。

背景技術

在過去的二十年中，微生物多樣性研究的方法有了飛速的發展。這些手段主要依賴于聚合酶鏈式反應(PCR)對目的基因的擴增。16S?rRNA基因是這類研究中使用最有效最普遍的分子標記。這些分子生物學方法的進展使我們能對未能培養的微生物進行一定的研究，有助于我們對來自各種環境中的未知微生物群落進行分類學和生態學層面上的研究。古細菌在形態學和生理學上都是多種多樣的。它們可以是球形、桿形、螺旋形、不規則形和多態形等。有些是單細胞的，而有些是形成菌絲體或團聚體。直徑范圍一般在0.1μm至15μm，一些菌絲體能長到200μm。古細菌通常在極端生境中被發現，例如產甲烷古細菌大量生長在含豐富有機物的厭氧環境中：沼氣池、動物的瘤胃和腸道系統、水域中的沉積物、沼澤濕地、溫泉，甚至是厭氧原生動物體內。目前，古細菌研究正在世界范圍內升溫，這不僅因為古菌中蘊藏著遠多于另兩類生物的、未知的生物學過程和功能，以及有助于闡明生物進化規律的線索，而且因為古細菌有著不可估量的生物技術開發前景。目前，微生物多樣性的研究主要依賴于對16S?rRNA基因這類研究中使用最有效最普遍的分子標記的分析。而這種分析通常需要使用PCR技術。引物是PCR的關鍵，直接影響到能否全面反映微生物多樣性。盡管有多種古細菌的16S?rRNA引物在研究中被用到，但缺乏適合于單方向測序可讀取長度的的此類引物。

發明內容

本發明的目的在于提供一對用于古細菌多樣性分析的針對16S?rRNA基因的引物。

為達到上述目的，本發明搜集了Sulfolobus?acidocaldarius，Sulfolobus?solfataricus，Sulfolobus?tokodaii，Archaeoglobus?fulgidus，Haloarcula?marismortui，Halobacterium?sp.，Haloquadratum?walsbyi，Natronomonas?pharaonis，Methanosphaera?stadtmanae，Methanothermobacter?thermautotrophicus，Methanococcus?maripaludis，Methanospirillumhungatei，Methanopyrus?kandleri，Methanococcoides?burtonii，Methanosarcinaacetivorans，Methanosarcina?barkeri，Methanosarcina?mazei，Pyrococcus?abyssi，Pyrococcus?furiosus，Pyrococcus?horikoshii，Thermococcus?kodakarensis，Picrophilustorridus，Thermoplasma?acidophilum，Thermoplasma?volcanium，Nanoarchaeum?equitans的全長16S?rRNA基因，運用MEGA4.0軟件進行序列排列，挖掘其保守區段的序列。隨后運用引物設計軟件Primer?Premier5.0進行引物設計。考慮到后續測序能力，每條序列單方向測序的有效讀取長度一般小于1000個堿基，所以設計出擴增片段長度約800個堿基對的引物，該引物的堿基序列為：

f，(5’-ACGGCTCAGTAACACG-3’)；r，(5’-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3’)。

與現有技術相比，本發明的用于古細菌多樣性分析的針對16S?rRNA基因的引物具有很好的通用性和實用性，能良好反映實驗對象中古細菌的多樣性，可以適用于來源于土壤，沉積物，人畜胃腸道等環境樣品的分析。

附圖說明

圖1是實施例1中的PCR電泳圖，S為PCR產物

圖2是實施例2中，根據所構建的16S?rDNA克隆文庫的測序結果所建立的系統發育進化樹的一個小分支。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆(Molecular?Cloning：A?Laboratory?Manual，3rd?ed.)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例一：使用本發明引物進行對環境微生物基因組DNA樣品的擴增