[發明專利]一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時熒光定量RT-PCR的方法

有效

• 申請號: 200810197411.9
• 申請日: 2008-10-28
• 公開（公告）號: CN101386893A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 鄭從義;黃璇;李勇;屈三甫
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時熒光定量RT-PCR的方法，適用于在單細胞水平上研究口蹄疫病毒的復制，進而分析病毒的急性感染與持續性感染的機理，探究在感染過程中病毒與宿主細胞的關系。

背景技術

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth?disease?virus：FMDV)屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，其所在的RNA病毒科在醫學和獸醫學上具有重要地位，該病毒主要引發偶蹄動物發生口蹄疫。基因組由一條正義的RNA鏈組成，約含8500個核苷酸，其復制經由一條互補的負鏈RNA作為模板。病毒感染其敏感細胞系(如倉鼠腎細胞系BHK-21或豬腎細胞系IB-RS-2)，宿主細胞會發生致細胞病變效應(CPE)，表現為細胞變圓，內細胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒還能在動物和細胞中建立持續性感染。

基于口蹄疫病毒基因組的特點，現已建立了許多相關的檢測方法包括雜交實驗(Verheyden，B，Lauwers，S，et?al.Quantitative?RT-PCR?ELISA?to?determine?theamount?and?ratio?of?positive-and?negative-strand?viral?RNA?synthesis?and?the?effectof?guanidine?in?poliovirus?infected?cells.J.Pharm.Biomed.Anal[J]，2003，33：303-308.)、常規RT-PCR(Hofmann，MA，Thür，B，et?al.Rescue?of?infectiousclassical?swine?fever?and?foot-and-mouth?disease?virus?by?RNA?transfection?and?virusdetection?by?RT-PCR?after?extended?storage?of?samples?in?Trizol[J].J.Virol.Methods，2000，87：29-39.)以及近年建立的實時熒光定量RT-PCR(King，DP，Ferris，NP，et?al.Detection?of?foot-and-mouth?disease?virus：comparative?diagnostic?sensitivity?of?twoindependent?real-time?reverse?transcription?polymerase?chain?reaction?assays[J].J.Vet.Diagn.Invest.，2006，18：93-97；Horsington，J，Zhang，Z.Analysis?of?foot-and-mouthdisease?virus?replication?using?strand-specific?quantitative?RT-PCR[J].J.Virol.Methods，2007，144：149-155.)。與其他的檢測方法相比，熒光定量RT-PCR技術優勢明顯，如靈敏度高、速度快、特異性強，可減少交叉污染等。然而所有的這些檢測方法都是基于群體細胞的檢測(組織塊或細胞系)，所獲得是群體細胞中病毒復制的數據，只能反映群體細胞中的病毒量而不能獲悉單個細胞中病毒的感染及其復制情況。