技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及消除生物組織玻璃化法保存低溫 斷裂的方法。

背景技術(shù)

玻璃化法是生物體超低溫保存的方法之一，這種方法由于能夠避免冰晶對(duì) 細(xì)胞或組織的機(jī)械損傷，近年來(lái)越來(lái)越受到重視。然而，玻璃化法也有著一定 的劣勢(shì)，除了高濃度的冷凍保護(hù)劑帶來(lái)的毒性損傷和滲透損傷外，由于某些原 因引起的熱應(yīng)力以及當(dāng)熱應(yīng)力達(dá)到某種程度而導(dǎo)致的低溫?cái)嗔熏F(xiàn)象，對(duì)成功實(shí) 現(xiàn)細(xì)胞和組織的低溫保存構(gòu)成了極大的障礙。熱應(yīng)力及低溫?cái)嗔褜?duì)細(xì)胞和組織 的損傷體現(xiàn)在以下幾方面。首先，熱應(yīng)力和斷裂會(huì)直接損傷細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道， 熱應(yīng)力導(dǎo)致的彈性變形和塑性變形會(huì)對(duì)細(xì)胞膜和組織造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷 (Rubinsky?B?et?al，Cryobiology，1980，17：66-73)。另外，還會(huì)通過(guò)促使反玻璃 化的發(fā)生或加重，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。對(duì)同樣的復(fù)溫過(guò)程，在降溫過(guò)程出現(xiàn)了 低溫?cái)嗔训娜芤罕葲](méi)有低溫?cái)嗔训娜芤焊菀追床ＡЩ?Steif?PS?et?al，Cell Preserv?Technol，2005，3(3)：184-200)。對(duì)大型的組織或器官來(lái)說(shuō)，組織內(nèi)會(huì)產(chǎn)生 宏觀的、或者微觀的相對(duì)位移，嚴(yán)重的斷裂會(huì)使組織變成碎片，使得組織失去 原有的功能。

玻璃化法保存中，引起熱應(yīng)力的因素主要有以下兩個(gè)方面。一是組織和玻 璃化溶液的盛載容器^[2]。一般地說(shuō)，組織和玻璃化溶液的盛載容器所用材料的熱 膨脹系數(shù)小于玻璃化溶液的熱膨脹系數(shù)，因此，在溫度變化時(shí)，容器和玻璃化 態(tài)固體的熱應(yīng)變不同，因而會(huì)產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力。除了容器的影響，較高的溫度變 化速率也是熱應(yīng)力和斷裂的產(chǎn)生的重要因素。對(duì)于常用的將凍存管直接投入液 氮的方式，會(huì)由于降溫速率過(guò)快使得凍存體系內(nèi)溫度梯度較大，進(jìn)而導(dǎo)致樣品 內(nèi)體積變化不均勻，產(chǎn)生熱應(yīng)力。熱應(yīng)力超過(guò)組織承受的極限就會(huì)引發(fā)斷裂現(xiàn) 象。在其他條件相同的情況下，溫度變化的速率越快，樣品內(nèi)的熱應(yīng)力越大， 樣品就越容易斷裂(Landa?V，F(xiàn)olia?Biol，1982，28：350-358；Lehn-Jensen?H?et?al， Theriogenology，1983，19：263-277；Rall?WF?et?al，Theriogenology，1989，31：683- 692)。

目前，關(guān)于如何消除組織玻璃化法保存中的低溫?cái)嗔训膱?bào)道很少。Song等 采用以下方法，即-100℃以上的溫度范圍采用較快速率，而在-100℃以下的溫度 范圍采用較慢速率，以避免玻璃體斷裂(Song?YC?et?al，Nature?Biotech，2000，18： 296-299)。具體地，首先以43±2℃/min快速降溫至-100℃，以避免降溫過(guò)程 產(chǎn)生冰晶，然后以3±0.2℃/min慢速降溫到-135℃以避免斷裂，之后轉(zhuǎn)移到-135 ℃的低溫冰箱里儲(chǔ)存；在復(fù)蘇時(shí)，首先以30±2℃/min慢速?gòu)?fù)溫至-100℃以避 免斷裂，然后以225±15℃/min快速?gòu)?fù)溫直至融化以避免反玻璃化和重結(jié)晶。 還有學(xué)者建議，可在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和低溫?cái)嗔褱囟戎g保存組織。然而，以 上方法只能在高于液氮溫度下儲(chǔ)存組織，而不能繼續(xù)降溫至液氮溫度同時(shí)避免 斷裂。而在高于液氮溫度下儲(chǔ)存組織，就存在使用何種廉價(jià)的介質(zhì)和設(shè)備以實(shí) 現(xiàn)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供消除生物組織玻璃化法保存低溫?cái)嗔训膬刹浇禍胤? 法，解決傳統(tǒng)的冷凍方法即一步法導(dǎo)致的低溫?cái)嗔褑?wèn)題；還可以解決現(xiàn)有的斷 裂消除方法中只能在高于液氮溫度下儲(chǔ)存組織，而不能繼續(xù)降溫至液氮溫度同 時(shí)避免斷裂的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：

步驟1，組織準(zhǔn)備：獲取組織后，將其浸沒(méi)于玻璃化溶液中，使保護(hù)劑充分 滲透到組織內(nèi)。然后，將組織放進(jìn)凍存管底部，加入玻璃化溶液完全浸沒(méi)組織， 在組織上方保持3～100mm的液層高度，在凍存管頂部保持1～100mm的空氣腔。

步驟2，裝置準(zhǔn)備：向液氮容器內(nèi)內(nèi)傾倒液氮，蓋上保溫蓋，穩(wěn)定5～20min。 確定氮?dú)鈭?chǎng)中溫度介于-196～-135℃所對(duì)應(yīng)的位置，即第一步降溫中樣品允許 放置的位置，以確定支撐板的厚度范圍。然后放入支撐板，穩(wěn)定5～20min。支 撐板可以采用能飄浮在液氮上的材料，也可以采用支架。