[發(fā)明專利]一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810182565.0
• 申請日: 2008-12-05
• 公開（公告）號: CN101748193A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王磊;姚英;曹勃陽
• 申請（專利權(quán)）人: 天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04
• 代理公司: 北京連和連知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11278
• 代理人: 姜兆元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因芯片和檢測用試劑盒，尤其涉及一種檢測下呼吸 道致病菌的基因芯片和試劑盒。

背景技術(shù)

呼吸道感染是感染性疾病中最常見種類之一，約占感染性疾病的 30％～40％，了解引起該類疾病的病原菌種類，特別是及時地培養(yǎng)、分離出 致病菌，對疾病的臨床診斷、藥物選擇及預(yù)后具有重要意義。

下呼吸道感染(氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎及肺炎)是嚴(yán)重威脅 當(dāng)今社會人群健康的感染性疾病。對于老年人和兒童這些免疫功能較弱者 的危害尤其嚴(yán)重。流行病學(xué)研究表明，每年急性呼吸道感染造成約200萬 5歲以下的兒童死亡，是這個年齡組兒童的主要死亡原因。約75％肺炎死 亡病例發(fā)生于1歲以下的嬰兒，而約1％的肺炎病例會留下后遺癥(如支 氣管擴(kuò)張)，這些后遺癥增加再次感染的危險性。在美國，肺炎在所有死 亡原因中列第6位，是最常見的致命性院內(nèi)獲得性感染。

根據(jù)關(guān)于下呼吸道發(fā)表文獻(xiàn)和醫(yī)院下呼吸道感染數(shù)據(jù)分析，引起下呼 吸道感染的最常見細(xì)菌為：金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動 桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫 拉菌。

國標(biāo)中臨床致病菌的方法多是采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定的方 法，報告檢驗結(jié)果大致需5～7天，加之檢驗方法繁瑣、費時費力。與實驗 診斷的其他科學(xué)相比，臨床微生物診斷方法的發(fā)展相對滯后。

1997年7月，Affymetrics，Inc.(Santa?Clara，CA)公司的Thomas?R. 等人發(fā)明的第6,228,575號美國專利公開了以生物芯片技術(shù)對微生物進(jìn)行 定種和表型分析的方法。從二十世紀(jì)九十年代開始，基因芯片技術(shù)作為一 種全新的核酸分析檢測技術(shù)建立起來，并隨著人類基因組計劃的開展而逐 步發(fā)展。該技術(shù)綜合運用了分子生物學(xué)、集成電路制造、計算機(jī)、半導(dǎo)體、 共聚焦激光掃描、熒光標(biāo)記等技術(shù)，使檢測過程具有敏感性高、特異性強(qiáng)、 大規(guī)模集成化、自動化、操作簡便快捷、效率高等特點，在基因表達(dá)相關(guān) 研究和生物制藥研究等方面得到普遍應(yīng)用。因此，如果將基因芯片技術(shù)用 于細(xì)菌的鑒定，不僅可以大大簡化檢測手段，提高檢測速度，而且具有高 準(zhǔn)確性、高靈敏度、高通量、可重復(fù)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點。

目前最常使用的微生物鑒定的靶分子是16S?rRNA和23S?rRNA，國內(nèi) 外已有很多文獻(xiàn)報道。利用16S?rRNA和23S?rRNA可將細(xì)菌微生物鑒定 至種或?qū)伲菍τ谟H緣關(guān)系較近的細(xì)菌種或?qū)俚蔫b定十分困難(Bodrossy L，Sessitsch?A.2004.Oligonucleotide?microarrays?in?microbial?diagnostics. Current?Opinion?in?Microbiology.7：245-25)。目前利用16S-23S?rRNA間區(qū) 作為靶分子進(jìn)行細(xì)菌的鑒定已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(Nubel?U，Schmidt PM，Reiβ?E，et?al.2004.Oligonucleotide?microarray?for?identification?of Bacillus?anthracis?based?on?intergenic?transcribed?spacers?in?ribosomal?DNA. FEMS?Microbiology?Letters?240：215-223.)，它的變異速率相當(dāng)于16S rRNA或者23S?rRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可將細(xì)菌區(qū) 分到型，對于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分具有16S?rRNA和23S?rRNA不 可比擬的優(yōu)勢。同時兩端是保守的16S?rRNA基因和23S?rRNA基因區(qū)， 可在兩端的保守區(qū)設(shè)計通用引物可避免了多對引物帶來的引物二聚體的 問題，長度在200bp-1000bp之間，大小易于操作，因而靶序列的擴(kuò)增和 標(biāo)記過程更加簡化，也更容易控制，符合操作簡便快捷的實際要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片，以彌 補傳統(tǒng)臨床下呼吸道致病菌檢測技術(shù)存在的費時耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌 檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強(qiáng)度，縮短檢測周期。

本發(fā)明所述的檢測下呼吸道致病菌的基因芯片包括固相載體和固定 在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述的該寡聚核苷酸探針包含從 以下序列中選取的一種或多種序列：