[發(fā)明專利]對蝦白斑綜合征病毒VP37p多肽片段與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810170610.0
• 申請日: 2008-10-19
• 公開（公告）號: CN101698673A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉慶慧;陳文博;黃捷;梁艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C07K16/08;C12N15/34;C12N15/63;A61K39/00;A61K39/395;A61K31/7088;A61P31/20
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)基因的核苷酸序列。具體地說，本發(fā)明涉及對蝦白斑綜合征病毒VP37的核苷酸序列片段(VP37p)，還涉及由該核苷酸部分序列編碼的一種具有粘附活性的多肽。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

對蝦白斑桿狀病毒(WSSV)是近年來危害我國及亞洲太平洋地區(qū)人工養(yǎng)殖對蝦的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染絕大多數(shù)種類的對蝦，此外還可侵染淡水及海洋生態(tài)系統(tǒng)中多種蟹類、龍蝦類、端足類、水蠅類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，因此它不僅嚴(yán)重危害對蝦養(yǎng)殖，還對海洋生態(tài)造成了影響。WSSV是雙鏈DNA病毒，基因組全長305Kb，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的動物病毒(J?Virol?200175：11811-11820)。基因組序列遺傳及形態(tài)學(xué)特征都表明WSSV是一種新病毒，它不屬于目前已知的任一種病毒家族，因此國際病毒分類委員會將WSSV歸屬為新的Whispovirus屬，Nimaviridae種(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。由于這是一個全新的病毒，而且WSSV基因組較大，所以絕大多數(shù)WSSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白與其他病毒沒有同源性，因此這些蛋白的功能無法通過與其他病毒蛋白的同源性分析進(jìn)行預(yù)測，因而使WSSV功能研究具有極大的難度。已有20余個基因初步確證其功能，尚有許多基因的功能未知。目前還難以對WSSV進(jìn)進(jìn)預(yù)防和控制，一方面由于WSSV能在自然環(huán)境中存活長時間，更重要的是人們對此病毒分子水平的了解還很少。粘附是病毒粘附蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合過程，粘附啟動病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，是建立感染、損傷細(xì)胞的必然途徑。病毒入侵宿主細(xì)胞前的識別和粘附是引發(fā)感染的關(guān)鍵步驟，病毒只有與細(xì)胞受體結(jié)合才能進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。近期的研究結(jié)果表明，WSSV感染宿主細(xì)胞的初期，必須具有完整囊膜結(jié)構(gòu)，表明WSSV感染宿主細(xì)胞初期必須首先經(jīng)過一個親和吸附和相互作用的過程。阻斷這一過程，將可能達(dá)到抑制WSSV感染的目的。目前已有應(yīng)用WSSV囊膜蛋白作為疫苗防止WSSV的專利，包括利用WSSV的VP28，VP26，VP24，VP19等。WSV254編碼的多肽片段活性分析表明VP37p不僅是WSSV的一種囊膜蛋白，而且為WSSV感染蝦體的粘附蛋白片段，更進(jìn)一步指出是RGD位點在起作用。本發(fā)明的創(chuàng)新處在于，應(yīng)用粘附蛋白多肽片段從阻斷WSSV與宿主相互作用控制WSSV的感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明中的編碼VP37p序列是如此獲得的。以純化的WSSV基因組DNA作為模板。根據(jù)WSV254序列的一部分(133bp-299bp)設(shè)計合成SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4的序列作為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了WSV254的部分序列SED?ID?No.1的序列。然后通過重組表達(dá)VP37p基因，純化VP37p基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過ELISA方法與熒光標(biāo)記的方法，確定其與對蝦細(xì)胞的結(jié)合活性，動物活體實驗分析其在甲殼動物抗WSSV感染抑制的作用。在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的VP37p序列。

本發(fā)明的目的是提供一種新的WSSV多肽，它包括：具有SEQ?ID?No.2氨基酸序列的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。較佳，該多肽是具有SEQ?ID?No.1序列的多肽。此蛋白被命名為VP37p。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的VP37p的方法。

本發(fā)明還提供了VP37p的應(yīng)用，即蛋白疫苗，其含有VP37p編碼序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。更明確的，本發(fā)明的這種疫苗含有SEQ?ID?No.2中所述的氨基酸序列或其衍生序列。

此外，本發(fā)明的核酸序列可以被用來制造核酸疫苗，對甲殼動物進(jìn)行接種，以抗WSSV感染。載體疫苗包括活的減毒細(xì)菌或病毒疫苗，以及藥學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明中分離的多核苷酸全長為167個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQID?No.1，其中開放閱讀框位于1-167位核苷酸。

另一方面，本發(fā)明還包括對VP37p?DNA或是其片段編碼的多肽能特異性相互作用的多克隆抗體、單克隆抗體及其它能抑制VP37p基因產(chǎn)物或片段。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.WSSV-VP37p基因的制備：

(1)WSSV病毒基因組的制備：將提純的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸鈉中，在65℃中靜置2h。用氯仿和苯酚抽提后將得到的產(chǎn)物溶于50μl?TE。-20℃保存，作為PCR擴(kuò)增模板。