[發明專利]產棒曲霉素真菌環介導等溫擴增快速檢測方法

無效

• 申請號: 200810157905.4
• 申請日: 2008-10-15
• 公開（公告）號: CN101381773A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: 雷質文;賀楠;房保海;李正義;唐靜;馬維興;張健;祝素珍;賈俊濤;趙麗青;姜英輝;劉云國
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明涉及一種利用環介導等溫擴增(LAMP)技術進行菌樣的快速檢測的方法，具體是一種產棒曲霉素真菌環介導等溫擴增快速檢測方法。

背景技術

棒曲霉素(Patulin)是青霉屬、曲霉屬、裸囊菌屬等多種真菌的次生代謝產物，在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中都有發現。棒曲霉素在動物實驗中能引起動物的致畸性、致突變性和致癌性，所以引起了世界各國衛生、毒理醫學、食品生產和安全等方面專家學者的極大關注，世界衛生組織(WH0)規定了食品中棒曲霉素的最高限量為50μg/L，目前歐盟已有更嚴格要求的趨勢。果制品中的棒曲霉素主要來源于青霉病，此病危害成熟或接近成熟的果實，病斑黃白色，近圓形，果肉腐爛呈錐狀濕腐，當條件適宜時，使全果腐爛，產生強烈的霉味，能產生棒曲霉素的有毒真菌有：展青霉、擴張青霉、棒狀青霉、土曲霉等。果汁中的棒曲霉素含量與原料品質、貯藏時間有關，通過調查實驗表明，采后立即加工生產的濃縮蘋果汁中棒曲霉素的含量最低，而隨著貯藏時間的延長，產品中棒曲霉素含量呈增加趨勢。一般而言，食品含有棒曲霉素并不會引起急性中毒反應，但動物測試發現，服食過量的棒曲霉素，會引致腸胃充血、擴張、出血和潰瘍。聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織聯合食物添加劑專家委員會在1990年及1995年先后就棒曲霉素進行風險評估，報告指出棒曲霉素有基因毒性，動物測試亦顯示棒曲霉素會抑制免疫反應、毒害神經，以及影響胎兒發育。

現有棒曲霉素及相應霉菌的檢測方法主要有微生物法、紙色譜法和高效液相色譜法，但果汁行業都以高效液相色譜法作為檢測棒曲霉素的標準方法，這種方法準確卻成本偏高。目前尚未見用環介導等溫擴增方法檢測產棒曲霉素真菌的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種產棒曲霉素真菌環介導等溫擴增快速檢測方法，以克服現有技術的缺點，從而為食品安全提供科學的依據和指導作用。

本發明的主要原理為：(1)特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個內引物(上游內引物和下游內引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成模板，產生一個原始的莖環DNA；(3)內引物以原始莖環DNA做模板，啟動鏈置換DNA的合成，產生一個原始的莖環DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環DNA；(4)在等溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA重復序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到10⁹拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增結果。

本發明涉及的產棒曲霉素真菌環介導等溫擴增快速檢測方法，其中包括的試劑如下(1)-(4)：

(1)環介導等溫擴增(LAMP)反應液：

其中包括10×Thermopol反應緩沖液、1.0—1.4mmol/L?dNTP、4—8mmol/L硫酸鎂(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引內物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游內引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜堿；

上游內引物：

5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA-3、

下游內引物：

5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3、

上游外引物：5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3、

下游外引物：5-TGAAGGAGCTCTGCACGATA-3、

其中混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。

其中所述的10×Thermopol反應緩沖液中含有200mmol?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris—HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L硫酸銨((NH₄)₂SO₄)、20mmol/L硫酸鎂(MgSO₄)和1％曲拉通X—100(Triton?X—100)；

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst?DNA聚合酶：8U/μL；