[發明專利]雞新城疫濃縮滅活苗的生產方法

有效

• 申請號: 200810153998.3
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101474401A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 熊蕊;楊保收
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: A61K39/17
• 分類號: A61K39/17;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及的是一種疫苗的生產技術的改進，具體地說，是一種雞新城疫濃縮滅活苗濃縮技術的改進方法。屬于生物工程領域。

背景技術

新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學中的位置屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒屬(Paramyxovirus)中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產蛋量下降，但可迅速康復。人類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結膜炎或淋巴腺炎，但很快便康復。新城疫病毒被OIE規定為A類疫病，是一種急性、高度接觸性傳染病，發病率和死亡率都在90％以上，1935年梁英、馬聞天等首次證實我國有該病的流行[1]，現在本病被我國列為I類疫病。

新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒顆粒具多形性，有圓形、橢圓形和長桿狀等。成熟的病毒粒子直徑100～400mn。包膜為雙層結構膜，由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結合衍生而來。包膜表面有長12～15nm的刺突，具有血凝素、神經氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分子與附在其上的蛋白質衣殼粒，纏繞成螺旋對稱的核衣殼，直徑約18nm。成熟的病毒是以出芽方式釋放至細胞外。

新城疫病毒對外界環境的抵抗力較強，55℃作用45min和直射陽光下作用30min才被滅活。病毒在4℃中存放幾周，在-20℃中存放幾個月或在-70℃中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發后8周之內，仍可在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒。

病毒對乙醚敏感。大多數去污劑能將它迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物質對它的消毒效果不穩定。3％～5％來蘇爾、酚和甲酚5min內可將裸露的病毒粒子滅活。在37℃的孵卵器內，用0.1％福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多種禽類和哺乳類動物的紅細胞。大多數毒株能凝集公牛和綿羊的紅細胞。在病毒的血凝試驗中，雞的紅細胞最為常用。

該病毒可在9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養，大多數毒株也可在兔、豬、犢牛和猴的腎細胞以及雞組織細胞等繼代或傳代細胞中培養。雞胚的成纖維細胞、雞胚和倉鼠的腎細胞常用于新城疫病毒的培養。

目前，雖然疫苗的使用使該病得到了有效控制，但由于疫苗免疫效果不理想，以及流行毒株的毒力增強和我國養雞業水平的參差不齊，使得該病仍然是嚴重危害我國養禽業的疾病之一，在我國經常有非典型新城疫的發生，甚至典型新城疫的爆發。

當前，防制該病所用的疫苗主要有活疫苗和滅活疫苗，其中活疫苗有弱毒疫苗II系、III系、IV系和中等毒力疫苗I系[2]，弱毒疫苗的缺點是不能突破母源抗體的干擾，中等毒力疫苗雖能突破母源抗體的影響，能夠快速的產生抗體，但可引起雞發病，存在散毒的危險，據報道可引起雞的非典型新城疫。滅活疫苗主要為油乳劑滅活疫苗，它可以避開母源抗體的影響，不存在散毒的危險，適合于任何日齡的雞免疫；但由于目前流行毒株的毒力增強，使得免疫劑量不斷加大，這給免疫帶來了不便，并且疫苗免疫的副反應增強，接種部位往往出現吸收不良或肉芽腫，影響了禽類制品的質量，給養禽業造成了一定的損失。因此，目前國內養雞業迫切需求免疫效果好、免疫劑量小的雞新城疫滅活疫苗，來解決以上問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種雞新城疫濃縮滅活苗的制備方法，使其提供副作用小、免疫產生時間早、免疫力強、免疫期長的疫苗。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

1)將雞新城疫病毒弱毒株凍干毒復溶，連續傳代接種雞胚9代，分別凍干保存，作為生產雞新城疫濃縮型滅活疫苗的基礎種毒和生產用種毒；

2)將病毒液滅活后，使用30KD膜包對病毒超濾濃縮5倍；

3)在高壓乳化泵中將濃縮后的水相與油相按1∶1比例混合乳化，即成雞新城疫濃縮滅活疫苗，滅活前的病毒含量＞10^6.3EID₅₀/0.1ml。

在一個具體實施方案中，雞新城疫病毒弱毒株優選是LaSota，效檢用強毒優選是雞新城疫病毒強毒北京株(CVCCAV1611株)，均為現行《中華人民共和國獸藥典》中“雞新城疫滅活疫苗”的生產和檢驗用毒種，購自中國獸藥監察所。

在一個具體實施方案中，所述的30KD膜購自Millipore公司。