[發(fā)明專(zhuān)利]HCMV－Towne－GFP重組巨細(xì)胞病毒及其制備方法與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810138250.6
• 申請(qǐng)日: 2008-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101319202A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周亞濱;張曉梅;彭瑩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/01
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張勇

1.一種HCMV-Towne-GFP重組巨細(xì)胞病毒，其特征在于：包括人類(lèi)巨細(xì)胞病毒基因組和US9-US10位點(diǎn)之間插入有綠色熒光蛋白基因的PHM673質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重組巨細(xì)胞病毒的制備方法，其特征在于：步驟如下：

(1)細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)：用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃，5％CO₂孵箱中傳代培養(yǎng)人胚肺細(xì)胞；將人巨細(xì)胞病毒Towne標(biāo)準(zhǔn)毒株接種于上述人胚肺細(xì)胞，常規(guī)傳代，用Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度，-80℃冰箱保存；

(2)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：用PHM673質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化；然后進(jìn)行質(zhì)粒的中量抽提，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)量獲得的產(chǎn)物的DNA含量，并進(jìn)行電泳鑒定質(zhì)粒，然后進(jìn)行質(zhì)粒的純化，獲得純化的PHM673質(zhì)粒；

(3)病毒重組：①脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)化克隆重組病毒的獲得：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24小時(shí)后去掉培養(yǎng)液，將0.2ml?HCMV-Towne標(biāo)準(zhǔn)毒株加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，32～35℃吸附1小時(shí)，增加培養(yǎng)基的體積至2ml，在5％CO₂、37℃孵箱中孵育24小時(shí)；換用含200ug/ml?G418的選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔3天換一次選擇培養(yǎng)基，用反復(fù)凍融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重組病毒空斑的純化：接種人胚肺細(xì)胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺細(xì)胞，37℃、5％CO₂孵育8～12天，熒光倒置顯微鏡觀察，將熒光陽(yáng)性孔挑出，即為轉(zhuǎn)染成功的重組病毒，轉(zhuǎn)移至新的人胚肺細(xì)胞中增殖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重組巨細(xì)胞病毒在抗巨細(xì)胞病毒藥物篩選中的應(yīng)用。