[發(fā)明專利]以臨床腫瘤病理組織切片為靶的SELEX技術(shù)方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810132913.3
• 申請(qǐng)日: 2008-07-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101619348A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵寧生;李少華;丁紅梅;黃艷萍;徐華;曹曉曉;楊光;趙強(qiáng);沈倍奮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

發(fā)明領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及臨床腫瘤病理組織切片消減SELEX篩選方法的建立和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)石蠟包埋臨床腫瘤病理組織切片的消減SELEX篩選，獲得識(shí)別該病理組織特異的單鏈DNA寡核苷酸配基，用于特定疾病包括腫瘤的檢測(cè)與輔助診斷等。獲得的寡核苷酸配基還可用于鑒定疾病狀態(tài)相關(guān)的分子標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物。

背景技術(shù)：

疾病發(fā)生、發(fā)展的不同階段都會(huì)涉及到多種分子水平的改變。例如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程與多種基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)方式、表達(dá)水平的改變有關(guān)。理論上講，這些大量的、有異于正常細(xì)胞的蛋白、核酸等生物大分子標(biāo)記物可以用于臨床輔助診斷與疾病檢控、轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)等。目前篩選疾病標(biāo)志物包括腫瘤標(biāo)志物一般應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，常用的是雙相電泳結(jié)合生物質(zhì)譜鑒定尋找疾病與正常對(duì)照(如腫瘤與正常對(duì)照)之間、或疾病不同發(fā)展階段之間的差異蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)具有高通量篩選的優(yōu)點(diǎn)，但亦有其局限性，如重復(fù)性差，樣品制備煩瑣、易造成蛋白酶解、丟失，對(duì)于特殊樣品(低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、極端分子量蛋白)難以囊括，分辨率低也是該方法難以克服的缺點(diǎn)，通常一個(gè)2-D膠只能鑒定1000-3000個(gè)蛋白點(diǎn)，而實(shí)際樣品可達(dá)10萬(wàn)個(gè)以上的蛋白，尤其對(duì)于臨床實(shí)體組織標(biāo)本，除目的細(xì)胞外還會(huì)有血管、基質(zhì)細(xì)胞等成分干擾。這使得實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性受到極大的挑戰(zhàn)。

新技術(shù)的應(yīng)用為通量、高效的鑒定腫瘤標(biāo)志物展現(xiàn)了廣闊的前景。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡(jiǎn)稱SELEX(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?EXponentialEnrichment)技術(shù)，是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫(kù)篩選技術(shù)。其原理是利用單鏈隨機(jī)寡核苷酸(包括單鏈DNA和RNA)三維結(jié)構(gòu)靈活易變并易與各種靶標(biāo)分子結(jié)合，形成具有很強(qiáng)結(jié)合力復(fù)合物的特點(diǎn)，將人工構(gòu)建合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留特異結(jié)合的寡核苷酸并經(jīng)PCR擴(kuò)增、富集、然后制備成富集的單鏈文庫(kù)再與靶分子重新相互作用，如此經(jīng)反復(fù)數(shù)個(gè)循環(huán)，即可篩選獲得與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸配基(aptamer)(Tuerk?C，et?al.Science1990；249：505-510)。aptamer具有精確識(shí)別、易體外合成與修飾等特性，因此在抗體涉及的領(lǐng)域幾乎均可用aptamer代替，在分析化學(xué)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景(邵寧生等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2006；33：329-335)。從最初的單一靶標(biāo)的篩選到后來(lái)的從混合體系中篩選某一類已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，SELEX顯示出了其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。尤其是近年來(lái)興起的復(fù)合靶子的SELEX技術(shù)，使得人們?cè)谀軌蛟诓恢腊蟹肿拥男再|(zhì)的情況下而對(duì)其進(jìn)行識(shí)別成為可能。這種可以不需要完全研究了解靶物質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)，就可以篩選任何狀態(tài)下的靶物質(zhì)，甚至可以通過(guò)篩選獲得的配基來(lái)研究靶細(xì)胞的分子標(biāo)志，為傳統(tǒng)的SELEX篩選提供了新的思路。

就篩選細(xì)胞而言，在理論上，以同源或相似的細(xì)胞進(jìn)行消減篩選可以獲得靶細(xì)胞特異的寡核苷酸配基，而且能區(qū)分細(xì)胞的所處的某種特定狀態(tài)，如我們率先建立的消減細(xì)胞SELEX篩選技術(shù)獲得了區(qū)分分化與未分化PC12細(xì)胞的寡核苷酸配基(Wang?C，etal.J?Biotechnol；2003：102：15-22)。國(guó)外Tan課題組利用相似的技術(shù)，以臨床白血病患者的腫瘤細(xì)胞為靶，篩選到了與白血病細(xì)胞特異結(jié)合的一組aptamer，能夠區(qū)分臨床標(biāo)本外周血中的白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞(Shangguan?D，et?al.Clin?Chem?2007；53：1153-1155)。由于無(wú)需考慮腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、標(biāo)志物的表達(dá)豐度等難控因素，因而在腫瘤研究領(lǐng)域有廣泛前景。但是，應(yīng)用體外培養(yǎng)的建系細(xì)胞株或者分離的細(xì)胞仍然無(wú)法模擬實(shí)體腫瘤組織中的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，因此如果能建立基于臨床腫瘤組織病理切片標(biāo)本(石蠟切片或冰凍切片)為靶的消減SELEX技術(shù)，利用獲得的特異aptamer釣取臨床病理組織特異標(biāo)志物，將會(huì)對(duì)疾病分子標(biāo)志物尤其是腫瘤特異標(biāo)志物的尋找?guī)?lái)全新的理念。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)以臨床腫瘤病理切片為靶的SELEX技術(shù)方法。