[發明專利]維生素B6磷酸鹽磷酸酶

無效

• 申請號: 200810132001.6
• 申請日: 2002-06-14
• 公開（公告）號: CN101386843A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 星野達雄;市川敬子;田副正明
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N1/20;C12P17/12;C12R1/41
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 李 劍

本申請是申請日為2002年6月14日的題為“維生素B6磷酸鹽磷酸酶”的申請02812553.3的分案申請。

技術領域

本發明涉及新的酶，即維生素B6磷酸鹽磷酸酶(vitamin?B6-phosphatephosphatase)(此后稱為VB6PP)，生產VB6PP的方法，和利用VB6PP及能生產VB6PP的特定微生物的無細胞提取物從維生素B6-磷酸鹽(后文指VB6P)生產維生素B6的方法。

背景技術

本發明“維生素B6”包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是人，動物和植物和微生物營養的重要維生素之一。

已知非特異性磷酸單酯酶如堿性和酸性磷酸酶水解各種磷酸-單酯化合物，包括VB6P，為對應的無酯化合物[Glenn?and?Dilworth，Arch.Microbiol.126：251-256(1980)]。沒有有關除純化自人紅細胞的磷酸酶外的VB6P特異性磷酸酶的報道[Fonda，J.Biol.Chem.267：15978-15983(1992)]。

發明內容

本發明目的是提供新的VB6PP，其作用于VB6P生產維生素B6。本發明VB6PP具有如下物化性質：

a)分子量：29,000±5,000(由具有分子量29,000±5,000的單體組成)

b)輔助因子(Co-factor):Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Sn²⁺，或Ni²⁺

c)底物特異性：對吡哆醇5′-磷酸鹽(下文指PNP)，吡哆醛5′-磷酸鹽(下文指PLP)和吡哆胺5′-磷酸鹽(下文指PMP)有活性

d)最適溫度：在pH?7.5下30-40℃

e)最適pH：7.0-8.0.

本發明另一目的是提供生產如上所述新的VB6PP的方法，其包括在水性營養培養基通氣(aerobic)條件下，培養能生產具有上述物化性質的VB6PP的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬微生物，破碎微生物細胞，從微生物的破碎細胞的無細胞提取物分離并純化VB6PP。

本發明另一方面是提供從VB6P生產維生素B6的方法，其包括將VB6P與(i)在Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Sn²⁺，或Ni²⁺存在下的如上所述VB6PP接觸，或(ii)屬于中華根瘤菌屬微生物的無細胞提取物，所述微生物能生產具有上述物化性質的VB6PP，在(i)和(ii)每一情況下，從反應混合物分離所得的維生素B6。

實施例制備的VB6PP純化樣品的物化性質如下：

1)酶活性

在二價金屬離子存在下，即Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Sn²⁺或Ni²⁺，本發明新的VB6PP催化VB6P水解為維生素B6，參照下式：

VB6P+H₂O→維生素B6+H₃PO₄

如下進行標準酶檢測：總體積125μl的基本(basal)反應混合物，組成為50mM?Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，1mM?MnCl₂，1.35μg酶，水加至總體積118.5μl，37℃下溫育1分鐘。然后6.5μl?800uM?PNP溶液加入得到40μM終濃度，全部在37℃溫育。溫育30分鐘后，反應混合物冰浴冷卻。如下兩種方法測定活性。(i)生產的維生素B6按照Osbone和Voogt的采用卡拉斯伯糖酵母(Saccharomyces?carlsbergensis)ATCC?9080，通過濁度方法進行微生物檢測[The?Analysis?of?Nutrients?in?Foods，Academic?Press，London，224-227(1978)]。一個單位酶活性定義為在如上的檢測系統中，30分鐘合成1μmole維生素B6的酶量。(ii)從推定底物釋放的磷酸鹽采用Geladopoulos等的malachite?green方法進行比色檢測[Analytical?Biochemistry?192：112-116(1991)]，此方法用于測定底物特異性和米氏常數(Km)以及最大速度(maximum?velocity)(Vmax)值。