[發明專利]蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp－AP5及其編碼的核酸序列

有效

• 申請號: 200810120143.0
• 申請日: 2008-07-24
• 公開（公告）號: CN101328479A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 慎小晶;葉恭銀;方琦;朱家穎;成雄鷹;胡萃
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A23K1/16;A61K38/17;A61P31/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及分子生物學、以及基因工程領域。特別是一種在蝶蛹金小蜂中表達的抗菌肽Pp-AP5及其核酸序列。

背景技術

近年來，由于藥物的濫用，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日漸嚴重，現有的抗生素藥物正在失去原來的療效，從而引發了人們對食品安全的關注，越來越多的國家開始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽(antibacterial?peptides)因其獨特的生物活性以及不同于傳統抗生素的特殊作用機理，已引起人們的極大的研究興趣，成為分子生物學和生物化學研究領域的熱點之一。各國的研究人員已經從哺乳動物及昆蟲、兩棲動物等中發現了幾百種抗菌肽，其中有些已經分離提取了出來，并對其結構、抗菌活性等作了許多的研究，發現其抗菌活性高效、廣譜，并且本身無毒、無害，對細菌、病毒、某些原蟲、真菌及腫瘤細胞等具有選擇性殺傷作用。

自1980年瑞典斯德哥爾摩大學Boman研究小組，首次由大腸桿菌注射誘導處理的惜古比天蠶蛾滯育蛹血淋巴中提純得抗菌肽以來，國內外許多學者就昆蟲源的抗菌肽已做了大量的篩選、活性測定，基因克隆與表達等工作，且明確昆蟲抗菌肽可分成天蠶素(cecropins)、防衛素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-rich?antibacterialpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich?antibacterial?peptides)(Brey?&?Hultmark，1998)。

作為地球上種類最多的生物，昆蟲具有繁殖快、適應性廣的特點，除海洋外，所有生態環境都有昆蟲的分布。自19世紀起，昆蟲就被作為免疫防衛系統的研究對象。尚存于地球上的昆蟲都是在劇烈的生存競爭中取得勝利后才生存下來的，它們在進化的過程中增強了抵抗各種病原菌侵染的能力，這就為我們篩選具有抗菌作用的昆蟲抗菌肽及其目的基因提供了豐富的基因資源庫，眾多研究人員從不同的昆蟲中發現了數百種抗菌肽。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其編碼的核酸序列。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5編碼的核酸序列，所分離出的DNA分子包括：編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ?ID?NO：1中從核苷酸第329-454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ?ID?NO：1中從核苷酸第329-454位的核苷酸序列雜交。

作為本發明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5編碼的核酸序列的改進：該序列具有SEQID?NO：1中從核苷酸第329-454位的核苷酸序列。

作為本發明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5編碼的核酸序列的進一步改進：該序列包含8～126個連續核苷酸。

本發明還同時提供了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，其具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

作為本發明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的改進：蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5為多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。

本發明所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其編碼的核酸序列，使其能夠應用在蝶蛹金小蜂中表達的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發成有應用價值的食品添加劑和藥物并應用于農業、工業和食品衛生等多個領域。

本發明的優點在于：本發明通過基于cDNA表達性文庫的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因的構建及高效克隆篩選方法，以蝶蛹金小蜂為實驗材料，篩選其體內表達的抗菌蛋白。該方法鑒于潛在抗菌蛋白/肽目的表達物能致死本身宿主菌的特點，將潛在抗菌蛋白/肽的蝶蛹金小蜂的基因的表達與表達物抗菌活性初步測定緊密相合，進行篩選。當篩選到表達物能使宿主菌死亡的克隆時，也就獲得了相應的源于蝶蛹金小蜂的插入之文庫中的目的基因。

具有抗菌作用基因的質粒轉化入SOLR菌后，在誘導劑IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的誘導下基因表達后產生抗菌的蛋白/肽，致使菌體的細胞膜收到破壞，從而允許染料分子進入細菌細胞，發生顯色反應，即觀察發現藍色的克隆。所以，這些被染成藍色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。將它們挑出后測序，就可得到相應的基因序列及其編碼的相應的抗菌蛋白。