[發明專利]水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養基質中除草劑的殘留

無效

• 申請號: 200810118019.0
• 申請日: 2008-08-06
• 公開（公告）號: CN101643777A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發明（設計）人: 蘇震;徐文英;邸超;周少霞;張蓋華
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養基質中除草劑的殘留。

背景技術

利用生物技術發展生態農藥是現代農業研究的一個重要方向，可以緩解農民負擔、減少生態環境污染和降低因大量農藥殘留造成的人類健康危害。細胞色素P450酶系是結合在內質網膜上含硫醇血紅素的氧化酶。細胞色素P450超基因家族存在很強的生物多樣性，廣泛參與動植物的各類生命活動，比如生物分子合成、解毒和藥物代謝途徑。利用功能基因組學和生物信息學手段，研究整合生物代謝途徑中的細胞色素P450家族的功能信息，研究預測與降解農藥殘留相關的水稻P450基因，將有利于生產我國自主性的生態農藥。以信號受體和轉錄途徑組分分析為基礎可進行農用化合物設計，結合化學信息學方法，可鑒定用于殺蟲劑和除草劑的潛在化學成分。

發明內容

本發明的目的是提供水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養基質中除草劑的殘留。

本發明所提供的輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的。該引物對是根據水稻細胞色素P450基因序列設計的，細胞色素P450基因命名為CYP709C5，其NCBI定位號為NP_001060386，NCBI基因號(GENE?ID)為Os07g0635500，DBJ號為AK121733，TIGR號為LOC_Os07g44140，全長cDNA序列長度為1564個核苷酸，定位于第七號染色體從26,381,064bp到26,382,763bp；該基因編碼的蛋白共有517氨基酸。CYP709C5基因的表達受除草劑的誘導，所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。

本發明的另一個目的是提供輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留的方法。

本發明所提供的輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中，以所述水稻的總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行實時熒光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待檢測的植物培養基質的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數與不含除草劑的植物培養基質的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數的比值，所述比值大于2.0±0.05，待測植物培養基質為有除草劑殘留的候選植物培養基質。

所述的植物培養基質可為任何可培養植物的液體或固體基質，如培養液、土壤、蛭石等。

當所述待測的植物培養基質為液體時，可將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到所述待測的植物培養基質中6小時-24小時；當所述待測的植物培養基質為固體時，可將所述待測的植物培養基質用5ml/100ml二甲亞砜水溶液浸泡，收集浸出液；將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中6小時-24小時。進行所述移栽的水稻可處于二葉期-四葉期。所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。

通過本發明提供的輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留的方法，可初步鑒定植物培養基質中是否有除草劑殘留，再結合現有的儀器分析方法可確定植物培養基質中是否有除草劑殘留。

為了方便、快速輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留，本發明還提供了一種專用的熒光定量PCR試劑盒，該熒光定量PCR試劑盒包含一對引物，該引物對由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成。

本發明根據一個對多種除草劑具有明顯應答特征的水稻細胞色素P450基因的基因序列設計了一對引物，用該引物對可輔助檢測植物培養基質中是否有除草劑殘留。利用本發明的輔助鑒定植物培養基質中除草劑殘留的方法可對植物培養基質進行初步篩查，將篩出的候選植物培養基質再用現有的儀器分析方法進行確定有無除草劑殘留，可大大降低儀器分析的工作強度，使對植物培養基質中除草劑殘留的檢測快速簡便。

附圖說明

圖1為水稻細胞色素P450基因，CYP709C5，在水稻基因組序列上的位置示意圖及基因結構。

圖2為CYP709C5基因在二氯喹啉酸的處理條件下表達變化。

圖3為CYP709C5基因在多種除草劑的處理條件下表達變化。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。

下述實施例中的水稻品種來自國家種質資源庫。

實施例1、CYP709C5在基因組序列的定位及引物設計