[發(fā)明專利]一種病毒聯(lián)合檢測技術(shù)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810117400.5
• 申請日: 2008-07-30
• 公開（公告）號: CN101638694A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永鋼
• 申請（專利權(quán)）人: 張永鋼
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是生物技術(shù)領(lǐng)域的一種病毒檢測試劑盒制備方法。核糖核酸的提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴增在同一個體系中完成，可用于DNA病毒或者RNA病毒的聯(lián)合檢測。

背景技術(shù)

自上世紀晚期逆轉(zhuǎn)酶發(fā)現(xiàn)以來，核糖核酸(RNA)的研究和應(yīng)用逐漸被人們所接受，在真核生物生物制品的開發(fā)和真核生物尤其是病毒的檢疫檢驗領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。核糖核酸的操作過程主要由核糖核酸的提取，逆轉(zhuǎn)錄和基因擴增三個步驟構(gòu)成，由于操作步驟較多，核糖核酸的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等因素的存在，實驗失敗或者檢測假隱性的幾率較高。尤其是在核糖核酸的提取步驟，對環(huán)境因素和人為因素的要求較多，雖然人們已經(jīng)能夠把逆轉(zhuǎn)錄和基因擴增過程一體化完成，但總體操作效果的改善并不明顯。

在DNA操作水平，因為PCR操作過程中存在高熱階段，可直接完成細胞的破裂，人們可以以細菌、細胞、組織塊甚至切片作為模板直接對細胞或者組織內(nèi)的基因片段進行擴增，不過在進行微生物菌落擴增時，我們發(fā)現(xiàn)由于細胞壁等因素的影響，部分微生物會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，而在病毒和噬菌體擴增過程中尚未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。而且在DNA操作水平，目前已經(jīng)有廠家如NEB，TAKARA，北京天根等公司將DNA聚合酶、底物和緩沖液混合預(yù)制成反映混合物獲得了成功，我們認為該方式同樣適用于核糖核酸的操作?；诖耍覀儗嶒灧椒ㄟM行了改進以簡化操作流程，目前國內(nèi)外檢測領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及生物體系領(lǐng)域一種病毒檢測試劑盒制備方法，由組織緩沖液和擴增體系構(gòu)成，其特征是：擴增體系由耐熱DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸、反應(yīng)緩沖液和擴增用引物預(yù)混合按照制成為擴增體系，分裝后備用；疫水或者組織提取液直接加入到擴增體系中混勻后可立刻進行擴增檢測。

本發(fā)明涉及的病毒檢測試劑盒制備方法所針對的對象可以使是DNA病毒或者RNA病毒；當檢測對象為RNA病毒時，試劑盒中耐熱DNA聚合酶選擇具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的耐熱DNA聚合酶，其中包括不限于TaqDNA聚合酶及其片斷、TthDNA聚合酶及其片斷、FD耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶(FD-TRT)及其片斷，可選擇其中一種或者幾種的混合物，優(yōu)選但不限于Taq?DNA聚合酶，同時根據(jù)所選擇酶系的工作特點選擇逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性反應(yīng)體系。

本發(fā)明涉及的病毒檢測試劑盒制備方法中，反應(yīng)緩沖液由緩沖體系，無機鹽、非特異性蛋白質(zhì)構(gòu)成；當檢測對象為RNA病毒時，反應(yīng)體系中可加入或者不加入核糖核酸酶抑制劑，其中核糖核酸酶抑制劑包括但不限于非特異性核糖核酸，核糖核酸酶抗體。

本發(fā)明涉及的病毒檢測試劑盒制備方法中，擴增用引物隊可以含有一到四千對針對相同或者不同病毒基因的引物對，其中優(yōu)選但不限于含有一到五對針對相同或者不同病毒基因的引物對；各引物對擴增產(chǎn)物的長度相差1到4000bp，優(yōu)選但不限于100到500bp。

實施方案

1、構(gòu)建擴增體系

1)選取適當?shù)木哂心孓D(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶系。

2)按照相關(guān)資料選用適合酶系逆轉(zhuǎn)錄活性和DNA聚合酶發(fā)揮作用的緩沖體系和離子組分配制反應(yīng)緩沖液和樣品緩沖液，并在其中加入或者不加入非特異性蛋白質(zhì)、非特異性核糖核酸和核糖核酸酶抑制劑。

3)配制適當濃度的三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物

4)配制適當濃度的擴增引物對，引物對可以有一種到四千種，優(yōu)選但不限于一種到五種；各引物對擴增產(chǎn)物的長度相差1到4000bp，優(yōu)選但不限于100到500bp

5)在預(yù)制反應(yīng)混合物方式中，將上述工具酶、反應(yīng)緩沖液和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合，制成1倍到10倍濃度的預(yù)制反應(yīng)混合物，優(yōu)選但不限于一到兩倍；低溫混合完成后李可分裝冷凍保存，其中可加入適量甘油。

2、樣品檢測方法

1)模板的制備：病毒載體可直接作為載體，加入到擴增體系中進行擴增；體外培養(yǎng)的動物細胞載體可熱滅活后或者直接加入到擴增體系中進行擴增；體外培養(yǎng)的植物細胞或者動物組織需要加入樣品緩沖液勻漿后，熱滅活或者直接粉碎后加入到擴增體系中進行擴增。

2)目的基因的擴增：在預(yù)制反應(yīng)混合物加入適量無菌水和模板；參照工具酶的工作特征設(shè)定工作程序進行擴增。

3)利用凝膠電泳或者叫磷酸檢測體系確定擴增產(chǎn)物的含量，優(yōu)選但不限于瓊脂糖凝膠電泳檢測體系。