[發明專利]氨基－羧基端互換的黃色熒光蛋白的新用途

有效

• 申請號: 200810116692.0
• 申請日: 2008-07-15
• 公開（公告）號: CN101315366A
• 公開（公告）日: 2008-12-03
• 發明（設計）人: 程和平;王顯花;陳敏;鄭銘;方華強;張宛睿;王艷茹
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及氨基-羧基端互換的黃色熒光蛋白的新用途。

背景技術

活性氧是一類化學性質非?；顫姷暮踝杂苫蚍亲杂苫?，它是一把雙刃劍，其 “好壞”取決于活性氧產生的時間、空間及濃度。在生理和病理條件下活性氧都起著 至關重要的作用。在生理條件下，活性氧參與多種生理功能，如前列腺素、凝血酶原 等的合成，核苷酸的還原，體內藥物、毒物解毒過程，吞噬細胞殺菌過程，另外，活 性氧作為信號分子參與多條信號通路，如誘導炎癥和免疫反應有關的基因表達，活性 氧還作為信號分子在細胞、組織和器官的發生、生長過程中發揮重要作用。在病理條 件下，在體內外的各種刺激作用下，活性氧可在體內大量產生、聚積，超過生理劑量 的活性氧可通過對脂質進行過氧化反應，破壞細胞膜的通透性，使細胞損傷及脂酶失 活，并可攻擊蛋白，使蛋白和蛋白酶變性、失活，還可通過堿基修飾損傷DNA，這些 直接作用都可以引起細胞損傷，甚至引起細胞凋亡或壞死；但超過生理劑量而又不足 以引起細胞壞死的活性氧更有可能作為信號分子啟動各種損傷反應。

活性氧主要產生于線粒體呼吸鏈，是電子在呼吸鏈傳遞過程中因電子漏而產生 的，其中超氧陰離子(superoxide?anion?radical，O₂^·-)是呼吸鏈的直接產物，隨 后超氧陰離子再被轉化為過氧化氫(hydrogen?peroxide，H₂O₂)、羥自由基(hydroxyl radical，·OH)等其他活性氧。

目前，在活細胞內檢測活性氧的指示劑主要是對活性氧敏感的熒光染料，其中， 被廣泛使用的是二氯熒光素雙醋酸鹽(2′，7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate，H₂DCFDA)，該熒光染料能夠比較靈敏的測定細胞漿中活性氧的水平，但 存在很多缺點，如在激光掃描下，它會和光子發生相互作用而產生活性氧；缺乏特異 性，能夠與多種氧化劑反應；由于該指示劑是有機化合物，不能被定位到特定的細胞 區域，只能測定細胞漿中的活性氧水平。因此迫切需要能定位到特定細胞器尤其是線 粒體中的特異于活性氧的指示劑。以熒光蛋白為基礎的活性氧指示劑既可以利用分子 生物學的手段對其改造，使其定位表達于特定的細胞器，又能夠特異性的測定不同種 類的活性氧，而且能夠在整體水平測定活性氧的水平，從而能夠測定不同的生理病理 條件下不同種類活性氧的時空特性。

發明內容

本發明的目的是提供一種氨基-羧基端互換的黃色熒光蛋白的新用途。本發明的 氨基-羧基端互換的黃色熒光蛋白可作為活性氧熒光蛋白指示劑，該活性氧熒光蛋白 指示劑能在分子、細胞及整體水平實時測定不同生理病理狀態下超氧陰離子的時空特 性。

本發明的活性氧熒光蛋白指示劑包括兩種，一是能檢測細胞漿中O₂^·-的活性氧 熒光蛋白指示劑，命名為cpYFP，是氨基-羧基端互換的黃色熒光蛋白，其氨基酸序列 為序列表中的序列1；二是能檢測線粒體中O₂^·-的活性氧熒光蛋白指示劑，命名為 mt-cpYFP，是在cpYFP的N端加了一段線粒體定位序列獲得的黃色熒光蛋白，其氨基 酸序列為序列表中的序列2。

本發明的活性氧熒光蛋白指示劑可通過將cpYFP或mt-cpYFP蛋白的編碼基因構 建到真核表達質粒、原核表達質粒和腺病毒表達體系中，再將構建的重組質?；蛳俨? 毒導入宿主細胞中而表達cpYFP或mt-cpYFP蛋白，cpYFP或mt-cpYFP蛋白能夠在分 子及細胞水平實時檢測O₂^·-的特性。

cpYFP蛋白的編碼基因具體可為序列表中的序列3；mt-cpYFP蛋白的編碼基因具 體可為序列表中的序列4。

本發明的另一個目的是提供一種能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法。

本發明所提供的能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法，是將cpYFP或 mt-cpYFP基因導入動物受精卵母細胞中，獲得能監測超氧陰離子變化的轉基因動物模 型。

其中，所述動物具體可為ICR小鼠。