[發明專利]小立碗蘚抗低溫基因Pptrigger factor-like protein及其蛋白和載體

無效

• 申請號: 200810111610.3
• 申請日: 2008-05-15
• 公開（公告）號: CN101580837A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 何奕昆;王慧;胡勇;崔素霞;孫銘明
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司
• 代理人: 楊小蓉

技術領域

本發明屬于生物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因基因Pp?trigger?factor-like?protein及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和轉基因細胞系。

背景技術

低溫、干旱、高鹽是限制植物生長發育、地理分布、形態建成等的重要環境脅迫因素。這些脅迫因素作用的結果均導致植物細胞失水，影響植物細胞的滲透壓，進而影響植物正常的生理代謝，嚴重時導致植物的死亡。通過對一些模式植物的研究發現這三種脅迫因素誘導表達的功能蛋白及轉錄因子相互交差，因此，尋求同時具有忍耐低溫、干旱、高鹽脅迫的綠色植物來研究植物的非生物脅迫極有必要。

對苔蘚植物的基礎研究標明：苔蘚植物是極地低溫度環境的先鋒植物之一，同時它也分布在極端干旱的沙漠。在漫長的生物進化歷程中，苔蘚植物形成了一套獨特的適應低溫干燥等惡劣環境的機制。對小立碗蘚非生物脅迫研究發現(Frank等，2005)，與其他高等植物相比，小立碗蘚(Physcomitrella?patens)可以忍耐極端的生態環境。如，擬南芥在100mM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003)，而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理條件下，小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醇處理三天后，小立碗蘚仍可以幸存。當小立碗蘚失水92％時仍可恢復正常生長發育。在脫水、鹽漬和滲透脅迫條件下，Frank等(2003)分析鑒定了一系列上調基因，其編碼的蛋白主要有膽堿脫氫酶(choline?dehydrogenase)、甜菜堿(glycine?betaine)、三氫吡咯羧酸鹽(deltal1-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent?protein?kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP?kinase)等。在0℃低溫脅迫七天后小立碗蘚仍可恢復生長(Minami等，2005)，且在冷馴化過程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉錄，提高了其冰凍耐受能力。

因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關基因并進一步通過轉基因等技術應用于提高農作物的抗逆性是目前研究的熱點之一。

發明內容

為了解決上述問題提出并完成了本發明。

本發明的目的是提供一種高效的抗低溫脅迫相關基因。

本發明的另一目的是提供上述基因編碼的蛋白質。

本發明的再一目的是提供含有上述基因的載體。

本發明的再一目的是提供表達上述基因的轉基因細胞系。

具體地，本發明的發明人將培養至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在0℃下經過不同時間的處理與非處理小立碗蘚莖葉體組成差異材料，通過cDNA-AFLP技術得到差異表達的EST，隨后在分子水平進行表達分析或蛋白質水平的分析，挑選出了一種具有顯著抗逆特性的基因-小立碗蘚抗逆基因Pp?trigger?factor-likeprotein，其堿基序列如SEQ?ID?No.1所示。

進一步，本發明還提供了上述基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

在本發明的完成過程中，還提供了包含上述基因的載體、以及表達該基因的轉基因細胞系。

本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。

附圖說明

圖1為Pp?trigger?factor-like?protein基因的cDNA-AFLP圖譜，其中，Maker：分子量標記；1、未馴化的24小時的材料；2、未馴化的12小時的材料；3、冷馴化的24小時的材料；4、冷馴化的12小時的材料。

圖2為Pp?trigger?factor-like?protein基因的Real-time?RT-PCR相對表達量變化圖。

具體實施方式

1、小立碗蘚的培養及冷脅迫處理

將小立碗蘚培養至15葉左右，移入0℃處理0、3、6、12、24、48、72小時，分別取材用于cDNA-AFLP分析。

附：小立碗蘚培養基配方及制備：

大量元素：

Ca(NO₃)₂·4H₂O?????0.8g/L