[發明專利]一種分離獲得植物內生菌的方法

無效

• 申請號: 200810107514.1
• 申請日: 2008-12-19
• 公開（公告）號: CN101434906A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 羅勝聯;肖瀟;萬勇;陳亮;郭函君;曹喆;蘇峰
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

技術領域

本發明屬于微生物學領域，涉及一種從植物中全面分離獲得植物內生菌的方法

背景技術

植物內生菌廣泛存在于各種植物中，他們對宿主的生命活動產生了巨大的影響，目前植物內生菌的研究正成為國際上生物、環境、化學等領域的熱點?，F有所公布的植物內生菌分離方法200710065724主要是利用機械力研磨離心的方法從植物組織勻獎中將植物內生菌分離出來。然而，在離心的過程中，很多內生菌可能仍然存在植物組織中未被分離。而植物內生菌的研究迫切希望盡可能獲得植物宿主體內所有的內生菌，而本發明使用的方法則能最大限度的獲得植物宿主體內全部內生菌。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分離獲得植物內生菌的方法，以期盡可能獲得植物宿主體內所有的內生菌。

本發明的目的是通過以下方式實現的。

一種分離獲得植物內生菌的方法，是經過植物預處理、表面消毒、內生菌的浸出、內生菌的分離純化四步，所述的內生菌的浸出過程為：經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為40-60μg/mL，0.15-0.3％SDS的8-12mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中25-35℃條件下120-180rpm振蕩50-90min，得上清液和植物殘渣。

內生菌的最佳浸出過程為：經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為50μg/mL，0.25％SDS的10mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中30℃條件下150rpm振蕩60min，得上清液和植物殘渣。

所述的植物預處理過程為：將采集好的新鮮植物用清水洗凈并將其根、莖、葉切成2厘米左右的小段。

所述的表面消毒過程為：在70％乙醇與2％次氯酸鈉溶液中浸泡進行表面消毒，浸泡后用無菌水沖洗5次以去除殘余表面消毒液。

所述的內生菌的分離純化過程為：在無菌條件下將內生菌的浸出過程中所得上清液、10倍和100倍稀釋上清液各100μL分別涂布TSB瓊脂平板；將植物殘渣直接印記至TSB瓊脂平板上，所有平板均于30℃恒溫培養2～14天后挑取不同形態的菌落，真菌至查氏培養基，細菌至TSB固體培養基中，劃線培養至純后于-80℃保存。

本發明的具體過程為：

1、植物預處理：

將采集好的新鮮植物用清水洗凈并將其根、莖、葉切成2厘米左右的小段，

2、表面消毒：

通過在70％乙醇與2％次氯酸納溶液中的浸泡進行表面消毒，浸泡后用無菌水沖洗5次以去除殘余表面消毒液，并取100μL最后一次洗液涂布平板于30℃下恒溫培養3天作為表面消毒的對照，若對照平板無菌落形成則證明表面消毒充分，后續步驟所分離獲得的均為植物內生菌。表面消毒液的浸泡時間為獲得充分表面消毒效果的最短時間。一般說來，植物的根莖表面消毒的時間要長于葉部。

3、內生菌的浸出

經表面消毒后的根、莖、葉小段分別在無菌條件下于纖維素酶濃度為40-60μg/mL，0.15-0.3％SDS的8-12mL滅菌PBS溶液中充分研磨，將研磨液轉入50mL錐型瓶中120-180rpm，25-35℃條件下保持50-90min，取上清液。在利用機械剪切力使植物內生菌浸出的基礎上利用表面活性劑與纖維素酶能分解植物纖維及植物細胞壁，使植物組織中的內生菌充分釋放出來，以獲得更好的植物內生菌分離效果。

4、內生菌的分離純化

在無菌條件下一方面將經步驟3的上清液作梯度稀釋，分別取原液、10倍、100倍稀釋液100μL涂布TSB瓊脂平板；另一方面，將植物殘渣直接印記至TSB瓊脂平板上，所有平板均于30℃恒溫培養2～14天后挑取不同形態的菌落，真菌至查氏培養基，細菌至TSB固體培養基中，劃線培養至純后于-80℃保存。

本發明的有益效果：

本發明方法與一般方法相比，不僅僅利用機械研磨和剪切力使植物內生菌浸出，同時加入表面活性劑和纖維素酶分解植物纖維及植物細胞壁，使植物組織中的內生菌更加充分釋放出來，獲得更好的植物內生菌分離效果。

對于植物內生菌的研究來說所得出的結論科學與否的根本在于是否能分離獲得植物體內所有的內生菌。因此，盡可能全面的分離獲得植物內生菌是全面研究植物內生菌的根本。利用本發明方法分離植物內生菌效果比一般分離方法效果顯著得多，因此，本發明是研究植物內生菌的優良方法。

附圖說明

圖1為一般分離法分離內生菌流程圖；

圖2為本發明方法分離內生菌流程圖。

具體實施方式