[發明專利]一種磷酸轉移酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 200810104087.1
• 申請日: 2008-04-15
• 公開（公告）號: CN101560507A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 邢新會;趙洪新;來奇恒;楊程;張翀
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12P19/32;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種磷酸轉移酶及其編碼基因與應用。

背景技術

呈味核苷酸是繼谷氨酸鈉(MSG)之后，助鮮效果更明顯、效率更高的新一代食品助鮮劑，被廣泛應用于食品加工領域。呈味核苷酸與谷氨酸鈉按一定比例混合使用時產生協同效應，使食品的鮮度提高數倍至數十倍，可使相同鮮度的助鮮產品成本降低40-60％。因此，作為食品的新型助鮮劑，呈味核苷酸的研究與應用引起了國內外的廣泛重視。

呈味核苷酸的呈味作用取決于其化學結構，只有核苷的5′位磷酸酯化才具有呈味作用[Yoshikawa，M.，T.Kato，and?T.Takenishi.Studies?ofphosphorylation.III.Selective?phosphorylation?of?unprotected?nucleosides.Bull?Chem?Soc.Jpn，1969，42：3505-3508.]，2′、3′位磷酸酯化沒有呈味作用。因此，目前有關生產呈味核苷酸工藝的研究，都是圍繞著如何使核苷的5′位特異磷酸酯化。5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸為代表性的呈味核苷酸，5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的結構如下：

5′-肌苷酸二鈉(5′-IMPNa₂)??????????5′-鳥苷酸二鈉(5′-GMPNa₂)。

從上世紀60年代日本開始實現核苷酸工業化生產以來，經過幾十年的研究，已經有多種生產核苷酸及其衍生物的方法。核苷酸的生產技術可分為以下三大類：核酸酶解法、直接發酵法及核苷發酵-合成法。

一、核酸酶解法

核酸酶解法是歷史最長、最成熟的生產呈味核苷酸的方法。利用桔青霉的5′-磷酸二酯酶與從酵母中提取的RNA反應，可得到四種5′-核苷酸的混合物。經離子交換樹脂分離純化，得到四種核苷酸產品。為提高酶反應的速度及操作性能，可以采用固定化酶或膜反應器工藝。雖然核酸的酶解方法反應簡單，但生產的核酸產物是混合物，要進一步得到5′-肌苷酸，需要將混合物進行分離純化，并對5′-AMP進行化學修飾或酶法轉化，才能得到5′-IMP。該方法分離純化操作復雜，占地面積大，整體生產效率較低。

二、直接發酵法

直接發酵法生產核苷酸主要利用微生物代謝直接從簡單的碳源和氮源生產5′肌苷酸或5′黃苷酸。直接發酵法生產肌苷酸的菌株主要有產氨短桿菌(B.ammoniagenes)、谷氨酸棒桿菌(C.Glutamicum)、嗜醋酸棒桿菌(C.acetoacidophilum)等。直接發酵法的生產菌株選育比較復雜。生產肌苷酸需要ATP的參與和再生，代謝途徑控制難，產生的肌苷酸易于被繼續分解。解決或解除終產物的反饋調節要比利用中間產物的代謝調控復雜得多，這一問題也限制了直接發酵法生產肌苷酸的工業應用。

三、核苷發酵-合成法

核苷發酵-合成法由發酵法生產核苷和磷酸化制備核苷酸兩步工藝組成。先利用簡單的碳源和氮源發酵生成核苷，再通過微生物酶的磷酸化反應，得到相應的核苷酸，其技術的關鍵問題在于如何將發酵生產的核苷高效地轉化為目的核苷酸。核苷的磷酸化反應，可以通過化學轉化和微生物酶轉化來實現。

化學轉化法可以將核苷進行磷酸酯化反應從而生成核苷酸，它是目前工業上常用的生產工藝之一。要利用化學法在核苷的5′位上導入磷酸基，得到5′-核苷酸，必須在磷酸化反應之前，使用適當的保護劑，保護核苷上碳2′和碳3′位的羥基不參與反應，然后在磷酸化反應結束后脫去保護劑。常用的核苷磷酸化試劑主要是磷酸或者焦磷酸衍生物，包括對三鹵氧化磷，焦磷酰氯、雙-對硝基苯焦磷酸等，而目前工業上廣泛采用的是三氯氧化磷。由于化學法所用的試劑較昂貴，許多化學藥品具有劇毒(如三氯氧化磷)，安全控制難度大，工藝要求高，環境污染嚴重，生產成本偏高。因此化學合成法一般用于生產一些有特殊用途的核苷酸的衍生物。

微生物中存在的核苷磷酸化酶可以不利用ATP將無機磷酸根特異的轉移到核苷分子的特定位置上，具有反應條件溫和、反應速度快、位置特異性強、轉化率高、環境友好等特點，而且和傳統的核酸酶解法及直接發酵法相比，催化過程簡單，不需要ATP參與，過程控制容易，在呈味核苷酸的生產方面具有重要的應用價值。主要問題是ATP再生過程細胞膜通透性的控制，系統穩定控制難度較大；反應副產物多，不利于產品的分離純化；只能進行批式反應；反應需要的時間長；轉化率還有待于提高。