[發(fā)明專利]鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及特異引物

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810102530.1
• 申請(qǐng)日: 2008-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN101245391A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳青君;張治軍;徐寶云;張友軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能夠特異鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及特異引物。

技術(shù)背景

西花薊馬是一種世界性的危險(xiǎn)性害蟲，起源于北美洲西部山區(qū)，最早記載于1895年，曾是美國(guó)加州最常見的一種薊馬，近年來(lái)侵入中國(guó)部分地區(qū)，被國(guó)內(nèi)有關(guān)專家確定為危險(xiǎn)性外來(lái)入侵害蟲。西花薊馬直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等葉片、花器或果面上留下疤痕及斑點(diǎn)。此外，西花薊馬還能傳播番茄斑點(diǎn)萎蔫病毒等在內(nèi)的多種病毒，且在若蟲取食植物30分鐘后即可獲毒，然后主要由成蟲傳播。目前已知其寄主植物多達(dá)500余種，包括重要的菊科、葫蘆科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是溫室種植的花卉、茄果類植物受害最重，因此采取措施防止西花薊馬對(duì)植物的危害非常迫切。但由于其卵、若蟲、成蟲都有很強(qiáng)的隱蔽性，對(duì)藥劑容易產(chǎn)生抗藥性，而常規(guī)的防治措施難以奏效，所以在防治及檢疫工作中，早期鑒定出西花薊馬并提早防治非常有現(xiàn)實(shí)意義。

目前為止，薊馬種類的鑒定主要以雌成蟲的形態(tài)特征為主，但是西花薊馬的成蟲體色具多態(tài)性---黑色、褐色和黃色，同時(shí)薊馬的若蟲、蛹無(wú)法通過(guò)形態(tài)鑒定到種，目前也有對(duì)未成熟時(shí)期的卵、若蟲或蛹進(jìn)行分類的研究，但仍在研究階段，尚無(wú)明確定論。然而在植物檢疫過(guò)程當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本為若蟲時(shí)，通常須繼續(xù)飼養(yǎng)至成蟲才能夠鑒定。這樣，不僅耗時(shí)，且蟲體微小，常常在飼養(yǎng)過(guò)程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)分子標(biāo)記技術(shù)，能很好地解決這些問(wèn)題。近年來(lái)，利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別昆蟲種類的研究非常多，可利用的標(biāo)記技術(shù)也非常多，但由于分析樣品的特殊性，對(duì)于選擇哪種分子標(biāo)記技術(shù)卻很重要。在DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中，若所研究的昆蟲DNA資料未知的情況下，利用RAPD-PCR技術(shù)是最簡(jiǎn)便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各種保存方式的標(biāo)本，也可做特定害蟲的快速鑒定(De?Barro?P?J，Driver?F.Use?ofRAPD-PCR?to?distinguish?the?B?biotype?from?other?biotypes?of?Bemisia?tabaci(Gennadius)(Hemiptera：Aleyrodidae).Austrilian?Journal?of?Entomology.1997，36(2)：149-152；Garner?K?J，Slavicek?J?M.Identification?and?characterization?of?a?RAPD-PCR?marker?for?distinguishing?Asianand?North?American?gypsy?moths.Journal?of?Insect?Molecuar?and?Biology，1996，5(2)：81-91；Haymer?D?and?McInnis?D.Resolution?of?populations?of?the?Mediterranean?fruit?fly，Ceratitiscapitata，at?the?DNA?level?using?random?primers?for?the?polymerase?chain?reaction.Genome?1994，37：244-248)。然而這種鑒定技術(shù)的開發(fā)需要收集完整的鑒定樣品作為對(duì)照，否則無(wú)法建立完整的分子標(biāo)記技術(shù)；為彌補(bǔ)樣品不足的缺陷，直接由已知序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)目的基因，不失為一有用的方法。根據(jù)文獻(xiàn)18S和28S?rDNA在所有生物中具有功能上和進(jìn)化上的同源性，其整體結(jié)構(gòu)和核酸序列在物種間非常保守，再加上中間包含保守區(qū)和變異區(qū)，適合于不同層次上的分類分析(Hillis?D?M?and?Dixon?M?T.Ribosomal?DNA：molecular?evolution?andphylogenetic?inference.Quarterly?Review?of?Biology，1991，66，411-453；CruickshankRH.Molecular?markers?for?the?phylogenetics?of?mites?and?ticks.Systematic?and?Applied?Acarology.2002，7：3-14)。然而在實(shí)際的分類鑒定實(shí)驗(yàn)中，由于我們得到的標(biāo)本量少至單頭蟲體，而薊馬體形微小，單頭提取的DNA濃度很低，即使運(yùn)用上述分子鑒定方法，也經(jīng)常因?yàn)槟０辶刻俣硅b定工作難以順利進(jìn)行。有研究者以線粒體DNA為分析模板，設(shè)計(jì)出特異鑒定出西花薊馬的特異引物，但由于線粒體DNA在細(xì)胞中含量較低，在實(shí)際鑒定實(shí)驗(yàn)中需要3-4頭蟲體才能完成鑒定(周力兵，劉忠善，李春艷，丁元明：PCR法鑒定西花薊馬，植物檢疫，2007，21(2)：78-81)。