[發明專利]層粘連蛋白化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 200810102004.5
• 申請日: 2008-03-14
• 公開（公告）號: CN101377508A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發明（設計）人: 蔣冰飛;應希堂;胡國茂;唐寶軍;張坤
• 申請（專利權）人: 北京科美東雅生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76;G01N33/577;G01N33/543
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技術領域

本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種層粘連蛋白(LN)生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光免疫分析技術測定試劑盒及其制備方法。

背景技術

肝纖維化是肝硬化的前期病理階段，是肝臟受到慢性損傷時，細胞外基質可逆性沉積的創傷愈合過程，許多慢性肝臟疾病均可引起纖維化。目前肝纖維化主要的診斷方法包括影像學診斷、病理診斷和血清學診斷三種。影像學診斷在臨床上應用廣泛，但只能在肝纖維化晚期發生肝硬化和門脈高壓癥時才能出現異常圖象。而肝纖維化的診斷金指標-肝組織活檢，由于所取標本量較少，以及肝臟病變的不均一性，會導致取樣誤差。鑒于影像學和病理診斷的局限性，人們經過試驗和病例研究發現，透明質酸(HA)、IV型膠原(CIV)、III型前膠原肽(PIIIP)和層粘連蛋白(LN)等血清學指標對肝纖維化的診斷有一定價值。并且肝纖維化是一個慢性的漸進性的過程，血清學檢測更有利于對組織肝纖維化的動態觀察。

正常肝臟間質層粘連蛋白含量較少，但在肝纖維化和肝硬化時，肌成纖維細胞增多，大量合成和分泌膠原、層粘連蛋白等間質成分形成完整的基底膜(肝竇毛細血管化)。層粘連蛋白與纖維化程度和門脈高壓正相關，在纖維化后期升高尤為顯著，因此可以反映肝纖維化的進展與嚴重程度。

近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用于生物醫學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有：放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學發光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發出的信號各不相同。根據大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，依次為：化學發光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。目前層粘連蛋白檢測方法主要有放射免疫分析法，酶聯免疫吸附層析和時間分辨熒光免疫分析方法等，以酶聯免疫吸附層析方法最為普及。放射免疫分析法存在諸多缺點，如操作復雜、測定結果不穩定、試劑保存時間短、放射性污染、儀器昂貴等，時間分辨熒光免疫分析方法也需要稀有金屬進行標記，而采用化學發光免疫分析方法的產品較少。

生物素-親和素免疫放大技術可極大地提高檢測方法的靈敏度，且特異性強，穩定性高，適用范圍廣，實驗成本低。生物素-親和素免疫放大技術有兩種基本類型，一類以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素大分子的待測反應體系和標記生物素，后在此基礎上發展了親和素-生物素化酶復合物技術；另一類是直接用標記親和素連接生物素化大分子反應體系進行檢測，稱為標記親和素-生物素法。根據待測反應體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，又分為直接法和間接法。在間接法中，親和素-生物素系統可以與免疫分析檢測體系偶聯，放大終反應：先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物，再加入已標記示蹤物的親和素與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。

目前，生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光免疫分析技術在層粘連蛋白免疫分析產品的應用方面比較少見。化學發光免疫分析法結合生物素-親和素免疫放大技術是一種較先進而有效的方法。利用生物素-親和素系統間接包被抗體能達到良好的效果，而且更有利于包被抗體與抗原的結合，從而在一定程度上起到信號放大的作用。另外，現有技術中的化學發光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發光測量系統，需要昂貴的全自動化學發光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發明的試劑盒主要采用微孔板化學發光免疫分析技術，既可應用于開放式的半自動化學發光測量儀，也可用于全自動的測量系統，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。

發明內容

本發明同時解決了上述問題，即將生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光技術與層粘連蛋白的免疫分析學有效地結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測層粘連蛋白的試劑盒，該試劑盒適于在產業上有效地推廣應用。

本發明的目的是提供一種生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光免疫分析測定層粘連蛋白的試劑盒及其制備方法。

根據本發明的試劑盒包括：1)層粘連蛋白校準品；2)親和素化的固相載體；3)生物素化的層粘連蛋白的單克隆抗體和酶標記的層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體的混合物；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)濃縮洗滌液