[發明專利]以SecA動力泵為靶點的抗革蘭氏陰性細菌藥物篩選模型及用途

有效

• 申請號: 200810097816.5
• 申請日: 2008-05-15
• 公開（公告）號: CN101580814A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 余利巖;趙莉莉;司書毅;孫承航;李秋萍;魏玉珍;張玉琴;劉紅宇
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12Q1/18;C12R1/19
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 程 泳

發明領域?

本發明涉及一種secA缺失的溫度敏感型重組大腸桿菌，其高效表達革蘭氏陰性細菌例如綠膿桿菌secA基因。本發明還涉及一種以SecA動力泵為靶點的新型抗革蘭氏陰性細菌藥物微生物細胞水平篩選模型，其利用高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌，以及野生型大腸桿菌和綠膿桿菌，用于針對SecA動力泵靶點對候選微生物的次級代謝產物進行微生物細胞水平的抗革蘭氏陰性細菌藥物篩選。所述模型還可用于針對候選化合物的篩選。?

發明背景?

當前，革蘭氏陰性細菌仍然是醫院與社區感染中最重要的致病菌，而且耐藥問題在革蘭氏陰性細菌的感染治療中也越來越成為一個難題。耐藥革蘭氏陰性細菌多為條件致病菌，占醫院臨床檢出的耐藥病原菌60％～81％[1、9、10]。常見的致病菌有：綠膿桿菌、大腸桿菌及腸桿菌屬、陰溝桿菌、沙雷菌屬、沙門菌屬、枸椽酸菌屬、肺炎桿菌、不動桿菌、流感桿菌等。耐藥機制主要有：細菌細胞膜通透性改變；細菌主動外排系統；PBPs改變；產生β-內酰胺酶、鈍化酶、酯酶、乙酰轉移酶等滅活酶。而解決這一問題最為有效的方法就是尋找和發現新的作用機制的、與已有的抗生素無交叉耐藥的新型抗革蘭氏陰性細菌的藥物。?

銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，又名綠膿桿菌，是假單胞菌屬中的代表菌種。最早是在1882年從病人化膿的傷口中分離出來，但到目前為止，它仍然是一種重要的院內感染條件致病菌，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥，肺炎，泌尿系統感染。近幾?年的研究還表明綠膿桿菌與大多數囊性纖維化病人的發病率和死亡率有關[4]，在成年的病人中，81％的感染了綠膿桿菌[5]，綠膿桿菌中磷脂酶C的產生與病人肺功能的降低與病情的惡化相關[6]。由于綠膿桿菌外膜通透性低并存在著外排多種物質的主動外排系統(ActiveEfflux?Systems)，使得綠膿桿菌具有先天的多重耐藥性，而當細菌與抗生素接觸后，又可以產生抗生素的修飾酶；降低抗生素作用位點的敏感性而獲得的后天的耐藥性，導致經常表現對β-內酰胺類、氯霉素類、喹諾酮類、磺胺類等多種抗生素的多重高度耐藥，臨床治療十分困難，一旦感染，死亡率很高，已經成為臨床醫生面臨的治療難題之一。因此，迫切需要發現新的抗綠膿桿菌等革蘭氏陰性細菌的藥物。?

從成千上萬個微生物代謝產物中挑選所需的抗菌藥物是非常艱難的一個過程。目前開發新型有用的微生物藥物，雖然仍有很大的潛力，但研究工作的難度越來越大，耗時越來越長，需要的資金也越來越多。因此，針對候選微生物的簡單、快速、特異的篩選模型是關鍵。為擺脫篩選的盲目性，提高效率，有必要進行定靶篩選，從細菌生存所必須的組成成分或者臨床有效抗生素的作用機理和細菌的耐藥機理來設計篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強、對耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。?

為獲得新抗革蘭氏陰性細菌藥物，本發明人引入了一個嶄新的藥物作用靶點，即：以SecA動力泵為靶點，通過本發明所述篩選模型，篩選新的抗綠膿桿菌或大腸桿菌以及其它耐藥菌的新化合物。?

發明內容

眾所周知，蛋白質的翻譯是在細胞質中進行的，但是研究表明在革蘭氏陰性細菌中，大約有三分之一的蛋白質必須穿過細胞內膜運送到周質或分泌到細胞外才能發揮它們正常的功能[7]。細菌中含有多種蛋白質轉運的途徑，但最主要的途徑被稱之為分泌途徑(secretionpathway)，簡稱為Sec途徑。大多數的分泌蛋白和一些整合膜蛋白的轉運都是通過這條途徑進行的[8]。分泌蛋白是以前體的形式合成的，?其氨基端都含有信號肽。它們通過共翻譯或翻譯后轉運的形式穿過細胞內膜[9]。這一過程是由轉運酶所催化的[10]。轉運酶是由多個亞基組成的復合體，其中的核心部分包括SecY、SecE和SecG組成的膜整合區以及SecA二聚體組成的外周區[11]。而其它的組分包括SecD、SecF和YajC都不是蛋白質轉運所必須的，但與蛋白質轉運信道的穩定性和轉運效率有關[12]。蛋白前體以非折疊的形式，通過ATP和PMF的能量輸入形式進行跨膜轉運，最終信號肽在周質中被信號肽酶水解除去。釋放的成熟蛋白或在周質伴侶分子的作用下折疊成它正確的構象或繼續被運送到細胞外或嵌合到細菌外膜中。?