[發(fā)明專利]一種用于限制片段長度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200810096857.2 | 申請日： | 2008-05-07 |
| 公開（公告）號： | CN101314774A | 公開（公告）日： | 2008-12-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李兵;沈衛(wèi)德;許雅香;衛(wèi)正國;陳玉華 | 申請（專利權(quán)）人： | 蘇州大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12P19/34 |
| 代理公司： | 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 | 代理人： | 陶海鋒 |
| 地址： | 215123江蘇省*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 限制 片段 長度 多態(tài)性 研究 家蠶 dna 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種家蠶DNA的抽提方法，具體涉及到一種適合于限制片段長 度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法。
背景技術(shù)
限制片段長度多態(tài)性(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism， RFLP)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研 究。這一技術(shù)的開展需要以個(gè)體作為研究對象，即需要抽提出個(gè)體內(nèi)高純度和 高濃度的DNA，用于RFLP的相關(guān)研究。
家蠶(Bombyx?mori?L.)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是用于遺傳學(xué)及分子生物 學(xué)研究的模式昆蟲。現(xiàn)有技術(shù)中，提取家蠶的DNA用于RFLP研究的技術(shù)主要 有以下幾種：
(1)常規(guī)的DNA抽提方法：是將家蠶整頭一起進(jìn)行研磨。
由于蠶體含有大量蛋白、脂類及色素，抽提出的DNA純度較低(OD260/280＜ 1.8)，進(jìn)行RFLP檢測時(shí)，限制性酶切往往切不徹底，不能進(jìn)行RFLP研究。
(2)將多頭家蠶的后部絲腺混在一起進(jìn)行DNA抽提。
雖然DNA的量是達(dá)到了RFLP研究的要求，但RFLP的研究需要DNA樣品來 源于個(gè)體而不是群體。
(3)目前國內(nèi)有些實(shí)驗(yàn)室也嘗試從家蠶個(gè)體后部絲腺抽提DNA做RFLP，但 由于傳統(tǒng)的抽提方法在抽提過程DNA損失量過大，只有10μg左右，不能對結(jié) 果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，DNA的樣就用完了。
要開展對個(gè)體作為研究對象的RFLP檢測，需要優(yōu)化DNA的抽提方法，抽 提出高質(zhì)量(OD260/280＞1.9)的足夠多(100μg以上)的DNA樣品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種適合于限制片段長度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提 方法，該方法能夠抽提出高質(zhì)量，高純度的家蠶DNA樣品用于RFLP研究。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種適合于限制片段長度多 態(tài)性研究的家蠶DNA抽提的方法，包括解剖家蠶取出后部絲腺，從家蠶個(gè)體 的后部絲腺抽提DNA，再采用RNase酶消解RNA，所述解剖家蠶取出后部絲 腺的具體步驟為：在無菌條件下解剖家蠶，取后部絲腺，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗， 將后部絲腺研磨至粉末；其中，從后部絲腺抽提DNA和采用RNase酶消解 RNA的具體步驟為：
(1)采用DNA酶解緩沖液融化后部絲腺粉末，混勻后將溶液于48～55℃水 浴裂解6～8小時(shí)；
(2)加入與步驟(1)中溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液；取與上 清液等體積的正丁醇與上清液混勻，離心后棄上清液，重復(fù)離心棄上清液的過 程至少1次，濃縮至0.1ml以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出DNA，然后用 TE緩沖液溶解DNA，混勻后至少放置0.5小時(shí)；
(3)于35～39℃水浴中，采用RNase酶處理步驟(2)中的DNA溶液，消解去 除RNA；加入與DNA溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，除去下層的酚層， 再加入同樣體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液；
(4)取與步驟(3)中的飽和酚等體積的酚氯仿，與步驟(3)所得的上清液混勻后 離心，再取上清液，并取與之等體積的正丁醇混合均勻，離心后棄上清，重復(fù) 離心棄上清的過程至少1次，濃縮至0.1ml以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出 DNA，用70～75％的乙醇洗滌，溶解于TE緩沖液中。
上述技術(shù)方案中，所述磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的成分和濃度為：
氯化鈉NaCl????????????137mmol/L，
氯化鉀KCl?????????????2.7mmol/L，
磷酸氫二鈉Na2HPO4?????4.3mmol/L，
磷酸二氫鉀KH2PO4??????1.4mmol/L；
所述DNA酶解緩沖液的組分和濃度為：
蛋白酶K???????????????0.2mg/ml，
十二烷基硫酸鈉SDS?????0.5％(重量比)，
四乙酸二氨基乙烯EDTA??????????????0.05M；
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