[發(fā)明專利]一種牛乳中過氧化物酶含量的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810093699.5
• 申請(qǐng)日: 2008-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN101256168A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫國慶;康小紅;胡新宇;劉衛(wèi)星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N27/447
• 分類號(hào): G01N27/447;C12Q1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分析檢測(cè)乳中蛋白的方法，特別是一種檢測(cè)牛乳中乳過氧化物酶含量的方法。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前，國內(nèi)沒有乳過氧化物酶含量的檢測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有已作廢標(biāo)準(zhǔn)和GB/T15550-1995活化乳中乳過氧化物酶體系保存生鮮牛乳實(shí)施規(guī)范。國外，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有DIN-10483-1-2002牛奶乳過氧化物酶活性測(cè)定.第1部分：光度測(cè)量法(參照法)、DIN-10483-2-2002牛奶乳過氧化物酶活性測(cè)定.第2部分：反射計(jì)法。常用乳過氧化物酶的檢測(cè)方法是酶標(biāo)儀法。該方法雖步驟簡(jiǎn)單，但檢測(cè)到出結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)，約2h。本專利發(fā)明了將使用毛細(xì)管電泳儀快速檢測(cè)乳過氧化物酶含量的方法。

毛細(xì)管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分離技術(shù)。它能快速精確檢測(cè)出牛奶中的摻假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含量。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，檢測(cè)到出結(jié)果時(shí)間僅為1h左右。

目前，毛細(xì)管電泳儀的應(yīng)用前景非常廣泛。許多國際官方權(quán)威機(jī)構(gòu)，如FDA、U.S.P、CBER、CDER等均已認(rèn)可毛細(xì)管電泳方法。權(quán)威機(jī)構(gòu)歐洲藥典中認(rèn)可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜質(zhì)的CE測(cè)定；歐洲藥典中還認(rèn)可促紅細(xì)胞生成素(EPO)的毛細(xì)管電泳儀測(cè)定等。毛細(xì)管電泳儀已成為化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物工程、藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的一個(gè)常規(guī)科研工具。

目前，國內(nèi)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用到乳品領(lǐng)域里，如產(chǎn)品開發(fā)和控制質(zhì)量問題等領(lǐng)域中。但毛細(xì)管電泳技術(shù)尚未開發(fā)檢測(cè)乳過氧化物酶的方法。本發(fā)明成功彌補(bǔ)了乳品領(lǐng)域中的缺點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè)定乳過氧化物酶的含量，從而有利于產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制當(dāng)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：一種牛乳中乳過氧化物酶含量的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的一種檢測(cè)乳過氧化物酶含量的檢測(cè)方法，其中，包括如下步驟：1)將乳過氧化物酶溶于樣品緩沖液，制備得到多個(gè)不同含量乳過氧化物酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)多個(gè)溶液分別檢測(cè)后得到乳過氧化物酶含量與檢測(cè)結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并得到檢測(cè)結(jié)果；3)將所述的檢測(cè)結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到樣品中乳過氧化物酶的含量；其中，檢測(cè)樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。

上述步驟1)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法如下：配制乳過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣品緩沖液中溶解乳過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測(cè)結(jié)果，即得到乳過氧化物酶含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測(cè)結(jié)果按照如下方法計(jì)算：按峰面積計(jì)算出平均校正因子。

上述的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測(cè)樣品的處理方法為：把標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測(cè)樣品裝入離心管中，在2000-4000r/min離心條件下離心5-15min，將樣品與緩沖液按照1∶4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)1～10min，使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。

上述的樣品緩沖液為：能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液：

160mmol/L三甲基氨基甲烷緩沖液中加40mmol/L?3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，6mol/L尿素，處理樣品時(shí)添加5ul/ml的β-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.5％，pH值為8.5

上述的搖勻步驟采用漩渦混合器。

上述高壓毛細(xì)管電泳分析的使用檢測(cè)參數(shù)如下：毛細(xì)管電泳檢測(cè)檢測(cè)的溫度控制在30～40℃之間，毛細(xì)管柱直徑50～75μm、長(zhǎng)度20～600mm，DAD(或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣(或電動(dòng)進(jìn)樣)，壓力為0～1psi，進(jìn)樣時(shí)間為1s～20s，分離溫度為20～40℃，工作電壓為15～30kV。

上述的毛細(xì)管柱為石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。

上述的高壓毛細(xì)管電泳分析的檢測(cè)時(shí)電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為pH3.0～8.0，主要成分為無機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選：磷酸鹽、硼酸或檸檬酸。

上述的檢測(cè)結(jié)果的處理方法如下：檢測(cè)結(jié)果為樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。