[發(fā)明專利]檢測磺胺甲噁唑殘留的免疫膠體金試紙條及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810089431.4
• 申請日: 2008-03-31
• 公開（公告）號: CN101245338A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 吳國娟;沈紅;裴兆柱;郭瑋;張中文;陸彥
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學院
• 主分類號: C12N5/18
• 分類號: C12N5/18;C07K16/18;G01N33/577;G01N33/558
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技術領域

本發(fā)明屬于獸藥殘留的免疫化學速測技術領域，具體地說，是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應，用于快速檢測磺胺甲噁唑殘留的免疫膠體金試紙條及其制備方法。

背景技術

磺胺甲噁唑是一種十分重要的磺胺類藥物，目前在獸醫(yī)臨床中仍被廣泛應用，主要用于治療動物的尿道、胃腸道和呼吸道感染，在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中磺胺甲噁唑也作為飼料添加劑用以預防疾病。

磺胺甲噁唑在體內(nèi)作用時間和代謝時間較長，大量或長期使用可使其在動物體內(nèi)蓄積，造成藥物殘留，對食品衛(wèi)生及人類健康構(gòu)成潛在危害性。急性中毒多見于靜脈注射速度過快或劑量過大時，主要表現(xiàn)為神經(jīng)興奮、供給失調(diào)、肌無力、嘔吐、厭食和腹瀉等癥狀，嚴重者迅速死亡。慢性中毒多由使用劑量偏大、用藥時間過長而引起，主要癥狀為：泌尿系統(tǒng)損傷，出現(xiàn)結(jié)晶尿、血尿、蛋白尿等；消化系統(tǒng)障礙；造血機能損傷，出現(xiàn)溶血性貧血，粒細胞、血小板減小，凝血障礙；幼畜及雛禽免疫系統(tǒng)抑制，免疫器官出血或萎縮，過敏反應，藥物熱或皮疹等。我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定，磺胺甲噁唑在所有食品動物的肌肉、肝、腎、脂肪中和牛、羊的乳中的最大殘留量分別為0.1μg/g，0.1μg/mL，并將其列為獸藥殘留監(jiān)控的重點。

目前檢測磺胺甲噁唑殘留的方法主要有兩種，一種為色譜分析，如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等，一種為免疫分析，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。

色譜技術對磺胺甲噁唑檢測是非常有效、準確的，但也存在如下缺點：(1)待測樣品預處理程序繁瑣費時；(2)需要經(jīng)過專業(yè)培訓的技術人員操作，操作人員要有豐富的相關經(jīng)驗，操作人員必須了解影響色譜分析的各種干擾因素，了解所使用方法的優(yōu)缺點，才能獲得可靠的分析結(jié)果；(3)需要昂貴的儀器設備輔助，難以在中小企業(yè)中普及；(4)儀器保養(yǎng)的要求高，保養(yǎng)的好壞直接影響分析結(jié)果的準確性；(5)檢測費用高。

酶聯(lián)免疫吸附法是以競爭性酶聯(lián)反應為檢測原理，以磺胺甲噁唑抗體包被酶標板，檢測時將被檢樣品和酶結(jié)合物同時加入酶標板，反應后通過顯色測OD值來判定結(jié)果。存在的缺點是：(1)需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用，不利于在基層單位進行推廣使用；(2)檢測操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓；(3)操作過程相對比較復雜，檢測所需時間比較長，全程需要2-4h；(4)檢測所需費用較高，不能實現(xiàn)單份檢測。

膠體金免疫層析(gold-immunochromatography?assay?GICA)是20世紀80年代發(fā)展起來的一項新的免疫分析方法，是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低的優(yōu)點。依據(jù)膠體金免疫層析技術，在國內(nèi)外無論人醫(yī)應用方面，還是獸醫(yī)應用方面，都已經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測試紙條。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的主要是在于克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測快速、準確的專門用于檢測磺胺甲噁唑的試紙條及其制備方法。

本發(fā)明的總體技術路線圖見圖1所示。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

為了實現(xiàn)本發(fā)明，申請人制備了一種能分泌抗磺胺甲噁唑的單克隆抗體雜交瘤細胞系，保藏號為CGMCC?No.2411。

一種適用于檢測磺胺甲噁唑殘留的試紙條，它包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)和PVC背襯(7)，其特征在于，在PVC背襯(7)上按順序依次粘附有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)；所述的結(jié)合墊(2)上包被有所述的抗磺胺甲噁唑單克隆抗體-膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有磺胺甲噁唑-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成檢測線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成質(zhì)控線(6)。

一種適用于檢測磺胺甲噁唑殘留的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括：

1)將磺胺甲噁唑與載體蛋白偶聯(lián)，形成磺胺甲噁唑-載體蛋白偶聯(lián)物；

2)用磺胺甲噁唑-載體蛋白偶聯(lián)物(人血清白蛋白)免疫小鼠，得到分泌抗磺胺甲噁唑的單克隆抗體的細胞系，其保藏號為CGMCC?No.2411；

3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體；

4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；

5)將步驟2)制備的抗磺胺甲噁唑單克隆抗體加入步驟3)制備的膠體金中，得到抗磺胺甲噁唑單克隆抗體-膠體金標記物；

6)將抗磺胺甲噁唑單克隆抗體-膠體金標記物包被在結(jié)合墊(2)上；