[發明專利]一種產甘油脫氫酶(GDH)的基因工程菌及其GDH制備方法

無效

• 申請號: 200810086324.6
• 申請日: 2008-03-24
• 公開（公告）號: CN101418274A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 方柏山;張婷婷
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及一種產甘油脫氫酶的基因工程菌及其甘油脫氫酶制備方法，也即一種產GDH的基因工程菌及其GDH制備方法。

背景技術

二羥基丙酮，英文名為dihydroxyacetone，簡寫為DHA，是最簡單的酮糖，易溶于水及乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑，在pH為6.0時穩定。國內有關DHA的報道極少，在國外DHA已得到廣泛的實際應用：(1)DHA分子中含有三種官能團，化學性質活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學反應，是一個重要的化學合成中間體，也是一個重要的多功能試劑，如在工業應用上，能最有效地還原丁二烯—苯乙烯復合物，催化甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應。(2)DHA被廣泛應用于化妝品中，起保濕及防曬作用：在制革工業上，DHA被用作皮革制品的保護劑。(3)DHA是一種重要的醫藥中間體，目前已作為醫藥應用在低血糖與糖尿病的治療上，限量口服DHA，跟葡萄糖相比，DHA能更大幅度地提高呼吸頻率，增大氧氣消耗，有效地防止過量β-羥基丁酸及乙酰乙酸的形成。(4)DHA可作為一種抗病毒試劑，如在雞蛋胚胎培養中，DHA能殺死51—100％的雞瘟病毒。另外，DHA還有許多其他用途，如作為食品添加劑等還在研究與開發之中。

二羥基丙酮(DHA)一般是從低產率的酶催化及通過其他微生物方法得到。自從1848～1849年Bertran發現某些微生物能將甘油轉化為DHA并鑒定該微生物為醋酸桿菌后，醋酸桿菌中甘油的代謝途徑及微生物(主要為醋酸桿菌)法生產DHA就開始被研究。到20世紀60～70年代，微生物法生產DHA在國外已得到了大規模的工業應用，微生物法生產DHA較之化學法生產有反應條件溫和、原料利用率高、產品純度高及工藝簡單、易于控制等優點，從長遠發展及環境保護角度來看，微生物法也顯得更具有生命力。而K.pneumoniae屬兼性厭氧菌，屬于病原菌，但實驗所用菌株較為溫和，在實驗室范圍內未見有其致病的報道，因此是比較適宜的GDH生產菌。

1998年Ahrens在美國《生物工程與工藝》(59卷第5期544-552頁)上發表，甘油轉化為1，3-PD的厭氧代謝途徑中，甘油沿著氧化和還原兩條平行路徑代謝。在氧化途徑中，甘油在依賴于NAD⁺的甘油脫氫酶(glycerol?dehydrogenase，下稱GDH，EC1.1.1.6)的作用下形成二羥基丙酮(dihydroxyacetone，下稱DHA)，再在二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetonekinase，下稱DHAK，EC?2.7.1.29)的作用下，生成二羥基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，下稱DHAP)，然后進入糖酵解途徑，這一代謝過程是以甘油為底物生長的微生物的共同代謝途徑，為微生物生長提供ATP和NADH。在還原途徑中，甘油在以維生素B₁₂為輔酶的甘油脫水酶(glycerol?dehydratase，下稱GDHt，EC?4.2.1.30)的作用下生成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，下稱3-HPA)，然后在依賴于NADH的1，3-丙二醇氧化還原酶(1，3-propanedioloxidoreductase，下稱PDOR，EC?1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供，整個過程伴隨著輔酶I的再生。

GDH、GDHt和PDOR是由dha操縱子上的不同基因編碼的，已有人利用基因工程技術對菌種進行改造，Ichinose等將來自于Escherichia?coli?strain?JM109基因組DNA中的甘油脫氫酶在大腸桿菌中表達，但從成本和生產能力上看都達不到工業生產的要求。另外有Stahl；Peter(Bernried，DE)等申請了從微生物中獲得甘油脫氫酶的專利(《從微生物中獲得高產、低Km值的甘油脫氫酶》1983年美國專利，218138)；有Adachi；Osao(Yamaguchi，JP)等申請了甘油脫氫酶的生產和應用的專利(《甘油脫氫酶的生產過程及其應用》，美國專利225328)。

發明內容

本發明的目的是提供采用基因重組的方法構建能生產GDH的工程菌，并提供以較低成本的發酵生產GDH的方法。

本發明所說的產GDH的基因工程菌的制備方法，是將目的基因插入載體pET-32a，構建重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌宿主細胞構建重組菌。再將重組菌培養至OD為0.4-1.2，通過乳糖誘導表達，獲得重組甘油脫氫酶。