[發明專利]一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法

無效

• 申請號: 200810073865.5
• 申請日: 2008-10-30
• 公開（公告）號: CN101381763A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: 李楊瑞;楊榮仲;方鋒學;桂意云;周會;劉惜輝
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;G01N30/02
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司
• 代理人: 王素娥

1.一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法，其特征在于，測定方法步驟依次如下：

1).SH培養基的組成與配制

用蒸餾水和蔗糖配制成含蔗糖10％、pH為5.8的培養基，簡稱SH培養基；分裝后121℃高溫15min備用；

2).取樣與樣品處理

取+5至+7葉的蔗莖帶回室內，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，無菌水沖洗、無菌紙除水，去蔗皮，取+6葉蔗莖中部切碎細小均勻，稱取樣品2g，轉入60ml培養瓶中，加培養基至總體積為10ml，用膠塞密封好；

3).溫育

將密封好的培養瓶轉入溫度為28℃，轉速為60—70轉/分鐘的搖床中，培養一天后，如為第3、4、5、6天測定，則為分別培養2、3、4、5天后，用注射器注入濃度為100％乙炔氣0.5ml，繼續放入搖床溫育一天，溫育結束后加入50％三氯乙酸250ul中止固氮酶活性；

4).標準曲線制作

用氣相色譜儀測定乙烯含量，根據氣相色譜柱類型，測試將乙炔和乙烯分離的溫度、時間及相關運行參數后制作乙烯的標準曲線，標準曲線標定乙烯的濃度范圍為0—200ppm；制作好標準曲線后，可對測試樣品的乙烯濃度進行測定；

5).乙烯含量測定

開機調入運行程序，在測定樣品前用已知濃度的乙烯樣品對儀器及相關運行參數進行校正，確定儀器正常后從樣品培養瓶中取500ul氣體注入氣相色譜儀的進樣器中，待儀器的運行程序結束后，記錄樣品的乙烯濃度；

6).固氮酶活性計算

固氮活性大小用nmol?C₂H₄·g^-1(Fw)·h^-1表示，計算公式如下：

固氮酶活性[C₂H₄·g^-1(Fw)·h^-1]＝C(V1-V2)/(M*Fw*h)

式中：C，標準曲線上對應的乙烯濃度(PPm)；

??????V1，培養瓶的體積(L)；

??????V2，裝入樣品及培養基所占用的體積(L)；

??????M，乙烯分子量；

??????Fw，樣品鮮重(g)；

??????H，加入乙炔后培養的時間(h)；

將記錄樣品的乙烯濃度C、培養瓶的體積V1、裝入樣品及培養基所占用的體積V2、乙烯分子量M、樣品鮮重Fw和加入乙炔后培養的時間H的數值代入上式中，計算出樣品的固氮酶活性值。