[發明專利]兩種抑制“肌肉生長抑制素基因”表達的合成小干擾RNA分子

無效

• 申請號: 200810072886.5
• 申請日: 2008-05-26
• 公開（公告）號: CN101591652A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 劉明軍;馬曉林;唐森;劉晨曦
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/79;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及能夠對肌肉抑制素基因產生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的設計、合成和抑制作用在肌肉細胞上的評價方法。

技術背景

肌肉的生長性狀(包括產量和質量)決定著肉用家畜的生產性能。產肉性能的好壞，除與家畜的營養和飼養管理因素有關外，主要決定于遺傳因素，即主要受與肌肉生長發育相關基因的調控。肌肉抑制素基因(myostatin，簡稱MSTN)是一種抑制肌肉細胞增殖生長的負調控基因，該基因表達的抑制或突變失活，能阻斷MSTN對肌細胞增殖生長的抑制作用，引起廣泛的肌肉增殖并顯著降低體表脂肪的沉積，產生以肌纖維數量顯著增加為特征的肌肥大現象，即所謂的“雙肌性狀”。根據國內外研究報道，目前在牛、羊、豬、人和鼠上都發現了與雙肌性狀相關的突變基因型。除突變基因型外，通過生物技術手段阻斷MSTN基因表達和功能，同樣能夠復制出類似MSTN突變產生的雙肌性狀。根據MSTN基因結構和作用機制，通過生物技術手段阻斷MSTN對肌肉生長的抑制作用來促進肌肉生長發育的研究已經成為MSTN研究的熱點。siRNA干擾技術是最近兩年來發展起來的阻斷基因轉錄表達的新技術，其阻斷基因轉錄的功能已在各種不同基因上得到了充分的證明，并被廣泛應用。針對MSTN的基因結構，設計合成能夠有效抑制MSTN基因表達的干擾RNA分子，對深入研究家畜肌肉生長發育的分子調控機制和研制促進家畜肌肉生長的生物制劑具有重要意義和廣闊的應用前景。

發明內容

根據GeneBank中MSTN從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共1128bp編碼區序列，用siRNA設計軟件設計干擾MSTN基因轉錄的siRNA分子群，從設計的87條siRNA分子中，根據結構和位置選出8條針對不同位點的siRNA序列進行合成。將合成的兩條單鏈互補的siRNA分子經退火形成雙鏈后，分別連接到pSilence4.1?siRNA專一性表達載體上，構建了8個干擾RNA質粒(pSi-MSTN)。干擾RNA質粒用脂質體轉染法轉染C₂C₁₂小鼠成肌細胞，建立了最佳外源基因轉染條件。48小時后收集細胞，提取細胞總RNA，通過實時定量熒光PCR檢測肌肉細胞MSTN?mRNA表達水平，分析了siRNA對MSTN的干擾抑制作用。通過分析比較實驗組和對照組細胞MSTN表達水平與肌細胞生長的相關性，評價了siRNA對MSTN基因表達的阻斷作用和促進肌肉細胞增殖生長的作用。最終獲得pSi-717和pSi-986兩種能夠有效抑制MSTN基因表達的siRNA分子載體，使用的siRNA分子分別用1、2、3、4標記序列。

具體實施方式

1、siRNA表達載體構建

各取10ul?10uM的兩條siRNA寡核苷酸(正鏈和互補鏈)，加入8μl?10×annealing?buffer和12μl滅菌超純水，煮沸10分鐘后自然冷卻至室溫。同時pSilencer4.1質粒載體經Bam?HI和Hind?III雙酶切后回收線性化質粒，與退火產物4℃過夜連接。連接產物轉化DH5a感受態細胞，LB平板氨芐青霉素(100ug/ul)篩選。用載體檢測引物及siRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆并送上海生工測序鑒定序列正確后，提取純化重組質粒用于轉染。

2、siRNA表達載體轉染C₂C₁₂細胞

轉染前一天按每孔2.5×10⁵個/mL的密度將C₂C₁₂細胞接種于六孔板，用2ml含有10％胎牛血清的DMEM培養液培養細胞。24h后細胞達到60％～70％匯合度時，將4μg的siRNA表達載體(包括無關基因對照質粒)和10μl(1μg/μl)的Lipo-fectamine^TM?2000加入50μl無血清的OPTI-MEMI，混勻后室溫下放置20分鐘。將質粒DNA和脂質體復合物加入含2毫升無血清DMEM培養液的細胞中，輕輕混勻，37℃、5％CO2培養箱培養12小時后，更換為含有10％胎牛血清的DMEM完全培養液。培養48小時后收獲細胞，用Trizol法提取總RNA。

3、siRNA抑制效果在肌肉細胞上的評價