[發明專利]創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝及其在水生動物的應用

有效

• 申請號: 200810071913.7
• 申請日: 2008-10-10
• 公開（公告）號: CN101361971A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 許斌福;林天龍;劉曉東;林能鋒
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P31/04;C12N1/20
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司
• 代理人: 丁秀麗

1.一種創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于，它包括如下步驟：(1)將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養，(2)對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活，(3)對滅活的菌液進行無活菌檢驗(4)離心收集滅活的創傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎，(6)免疫刺激復合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復合物；將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養的方法為：選擇TSB培養基和改良的TSB培養基；將經常規檢測合格的創傷弧菌毒株接種到含有TSB的細菌培養物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31℃恒溫、100-200轉/分鐘的條件下振蕩培養14-18小時，將該培養液作為種子液；以0.5-10％預擴增的培養物接種于發酵罐內的新鮮高壓滅菌的改良TSB培養液中大規模培養36-60小時；所述的改良的TSB培養液體積重量百分比W/V的成分為：葡萄糖0.18％-0.22％、胰蛋白胨1.2％-1.8％、大豆胨0.2％-0.6％、玉米漿0.2％-0.6％、磷酸氫二鉀0.15％-0.25％、氯化鈉1.0％-2.0％、磷酸鐵0.0005％-0.002％和酵母膏0.05％-0.2％；發酵培養條件參數為：接種量為培養基體積的0.5-10％、溫度25-31℃、轉速100-200轉/分鐘；空氣流量為35-151/min；培養基的pH值6.5-7.5；發酵20-28小時后按間隔3-10分鐘、自動工作15-20秒補濃縮料共500ml，所述的濃縮料的重量份數比為葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即為發酵菌液。

2.根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于：所述的對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活的方法為：將菌液收集于滅菌罐中，添加終濃度V/V體積百分比為0.1-0.5％的福爾馬林，室溫罐內翻滾震蕩3-5小時后，置于3-5℃冰箱中過夜或經過48小時，可徹底滅活；所述的無菌檢驗如下：充分搖勻細菌，滅菌槍頭吸取0.2-1.0ml的滅活菌液，超凈工作臺上鋪平板，放置26-30℃恒溫培養箱培養48小時，滅菌完全的培養物應當沒有菌落出現，試驗設空白平板對照。

3.根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于：所述的離心收集滅活的創傷弧菌的方法為：在8000-12000轉/分鐘的轉速下，離心20-30分鐘，收集、濃縮細菌；發酵培養細菌的生物量的濕重應為25-50g.l^-1；所述的離心收集的細菌用滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至生物量125-175g.l^-1。

4.根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于：所述的對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎的方法為：采用市售的JY98-3D超聲波破碎儀，超聲波的超聲探頭的直徑為20mm，超聲功率設為800瓦；將超聲波破碎儀用70％酒精進行潔凈消毒；將滅活的200-400ml的濃縮菌液放入專用超聲杯中，待濃縮菌液預凍或預溶至留有少量冰晶時進行低溫超聲破碎、控制超聲破碎倉內溫度不高于35℃；破碎的作用程序為：間隔時間10s，工作時間5s，如此循環反復作用總時間為6分鐘/輪；共作用3輪，全程時間為18分鐘，實際作用時間為6分鐘；指針顯示的輸出起始功率在720瓦左右，最后階段的功率可接近設置值800瓦。

第一次超聲波裂解后的用滅菌磷酸鹽緩沖液調整細菌蛋白濃度至8-12mg.ml^-1。

5.根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于：所述的免疫刺激復合物組分的配制方法如下：在超聲裂解的菌體粗蛋白中、每100ml菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2％W/V的皂苷和每ml菌液中各添加終濃度100-150μg.ml^-1的卵磷脂和膽固醇。

6.根據權利要求5所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于：配制卵磷脂和膽固醇時先將兩種物質溶解于氯仿中配成100-150mg.ml^-1儲存液，現配現用或-20℃凍存備用。