[發(fā)明專利]一種新型蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810071520.6
• 申請(qǐng)日: 2008-08-04
• 公開（公告）號(hào): CN101353372A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林峻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 林峻
• 主分類號(hào): C07K14/00
• 分類號(hào): C07K14/00;C12N15/09;C12N15/11;C40B10/00;G06F19/00
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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種根據(jù)蛋白質(zhì)分子的空間三維結(jié)構(gòu)或者如序列信息和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息等等所有有用的信息，分析其分子特性，理性選擇目的突變位點(diǎn)，并進(jìn)行隨機(jī)重復(fù)遞推式基因序列突變，之后通過篩選，獲得具有目的特性的新型蛋白質(zhì)分子的定向進(jìn)化方法。

背景技術(shù)：

荷蘭科學(xué)家格里特于1838年首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一種極為重要的高分子有機(jī)物，凡是有生命的物質(zhì)離開蛋白質(zhì)就無法生存。蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈組成的，每一條多肽鏈有十幾個(gè)至數(shù)百個(gè)不等的氨基酸殘基，各種氨基酸殘基按一定的順序排列。蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展，使得人類可以獲得離體的、純化的、并具有生物活性的蛋白質(zhì)，可用于生物醫(yī)藥和生物催化等等領(lǐng)域。可是，生物體內(nèi)天然存在的蛋白質(zhì)，其特性往往不盡人意，將其提取出來，并在體外使用時(shí)常常具有很多缺點(diǎn)，比如活性低，對(duì)高溫、低溫、高pH、低pH、高壓、輻射等等極端環(huán)境的耐受性差。因此需要對(duì)其進(jìn)行人工的分子改造，使合成的蛋白質(zhì)更符合人類的需要。由于每一種蛋白質(zhì)都有自己獨(dú)特的氨基酸排列順序(一級(jí)結(jié)構(gòu))，所以只要改變其中關(guān)鍵的氨基酸序列就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸又是由核酸序列上的三聯(lián)體密碼子決定的，因此只要改變構(gòu)成遺傳密碼的堿基序列就能達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。這一技術(shù)始于20世紀(jì)90年代，稱為定向進(jìn)化技術(shù)(Directedevolution)，其中運(yùn)用最為廣泛的實(shí)際操作方法為錯(cuò)誤傾向PCR(Error-prone?PCR)和DNA改組(DNA?shuffling)。其核心思想是隨機(jī)地改變編碼蛋白質(zhì)的基因序列，獲得文庫(kù)，然后通過大量的篩選，從文庫(kù)中獲得正向進(jìn)化的目的基因。但是此類方法的隨機(jī)性很大，其成敗與否和效果優(yōu)劣在于篩選量的大小和準(zhǔn)確性。數(shù)十年前，人類已知蛋白質(zhì)分子的理化特性和生物學(xué)活性直接取決于其空間三維結(jié)構(gòu)，而根據(jù)蛋白質(zhì)分子的空間三維結(jié)構(gòu)，可以分析出蛋白質(zhì)的生物活性和某一理化特性具體和哪些氨基酸殘基相關(guān)聯(lián)。隨著現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使用X射線衍射法和NMR法等方法，人類已經(jīng)獲得了很多蛋白質(zhì)分子的空間三維結(jié)構(gòu)，但是由于自然界存在的蛋白質(zhì)分子種類眾多，而通過實(shí)驗(yàn)方法解析蛋白質(zhì)分子的空間三維結(jié)構(gòu)費(fèi)用高，步驟繁雜，難度較大，因此，通過實(shí)驗(yàn)方法得到空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子的數(shù)量所占比例比較少。而近幾年，通過使用生物信息學(xué)的方法，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)，人工模擬蛋白質(zhì)分子空間三維結(jié)構(gòu)取得了很大的進(jìn)展。基于人工模擬的空間三維結(jié)構(gòu)或者實(shí)驗(yàn)方法解析出的空間三維結(jié)構(gòu)，分析出蛋白質(zhì)分子中可能與某一特性相聯(lián)系的氨基酸殘基的位置，并理性選擇這些位置，對(duì)基因進(jìn)行突變，可以提高正向進(jìn)化的效率，減小篩選壓力。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是通過使用X射線衍射法、NMR法等等實(shí)驗(yàn)方法解析蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。或者使用計(jì)算機(jī)技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的序列信息，模擬其空間三維結(jié)構(gòu)。進(jìn)而根據(jù)得到的三維結(jié)構(gòu)信息或者其它信息，分析其分子特性，理性選擇目的突變位點(diǎn)，并進(jìn)行隨機(jī)重復(fù)遞推式基因序列突變，之后通過篩選，獲得具有目的特性的新型蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明的定向進(jìn)化技術(shù)結(jié)合了理性過程和隨機(jī)過程的優(yōu)勢(shì)，其具體步驟如下：

1.獲得蛋白質(zhì)分子的核酸序列和氨基酸序列

通過使用基因工程學(xué)原理，用PCR法或者文庫(kù)法等等方法，得到目的蛋白質(zhì)分子的基因片段，然后再使用“酶切”、“連接”、“轉(zhuǎn)化”等等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將目的基因片段連上載體，導(dǎo)入宿主菌并保存。之后對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序，獲得基因的堿基序列，根據(jù)三聯(lián)密碼子，可以由基因序列轉(zhuǎn)換得到氨基酸序列。或者通過搜索Genbank、EMBL、DDBJ等等國(guó)際序列數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得目的蛋白質(zhì)分子的核酸序列和氨基酸序列，使用全基因合成法，合成目的基因(如果該序列信息受到專利保護(hù)，應(yīng)事先獲得專利所有者的授權(quán))。

2.獲得三維結(jié)構(gòu)信息

目的蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)信息可以通過實(shí)驗(yàn)法和計(jì)算機(jī)輔助模擬法得到。

實(shí)驗(yàn)法包括X射線晶體衍射法和NMR法。X射線衍射分析主要是根據(jù)衍射線的方向和強(qiáng)度，即衍射圖案上斑點(diǎn)的位置和黑度，通過電子計(jì)算機(jī)，繪制出電子密度圖，從中構(gòu)建出三維分子圖像。NMR分析的原理是：處于一個(gè)靜磁場(chǎng)中的核子會(huì)由于磁場(chǎng)的作用而處于不同的能量狀態(tài)，當(dāng)一個(gè)外界的擺動(dòng)的磁場(chǎng)來擾動(dòng)處于“平衡”狀態(tài)的核子時(shí)，吸收了能量的核子就會(huì)在不同的能級(jí)之間躍遷，并在此過程中釋放出能量。而放出的能量被檢測(cè)到之后，經(jīng)過分析和計(jì)算就可以得到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。