[發(fā)明專利]甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810071436.4
• 申請(qǐng)日: 2008-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101328501A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高三基;潘永保;陳平華;陳如凱;許莉萍;張華;徐景升
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PCR檢測(cè)方法，尤其是甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

甘蔗宿根矮化病(Ratoon?stuning?di?sease，RSD)是由寄生在甘蔗木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的Leifsonia?xyli?subsp.xyli(Lxx)病菌引起。目前應(yīng)用于甘蔗宿根矮化病的PCR檢測(cè)技術(shù)，首先需要從甘蔗蔗汁或蔗莖組織提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。而病菌DNA的提取需要經(jīng)過(guò)一系列步驟，即CTAB緩沖液裂解，氯仿/異戊醇抽提，醋酸鈉和無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌等過(guò)程。其過(guò)程復(fù)雜、繁瑣、耗時(shí)，很難應(yīng)用于甘蔗病害大規(guī)模檢測(cè)和甘蔗早代RSD抗病育種研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗RSD病菌PCR快速檢測(cè)的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：甘蔗RSD病菌加入BufferA試劑，經(jīng)過(guò)95℃水浴10分鐘后，再加入Buffer?B試劑，甘蔗RSD病菌即可裂解出Leifsonia?xyli?subsp.xyli基因組DNA，然后作為PCR反應(yīng)的模板。

本發(fā)明的甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于具體步驟如下：

1、提取蔗汁：在甘蔗的基部節(jié)間取蔗汁1～1.5mL置離心管A中，室溫下3000rpm離心4～6min，取上清液300～400μL放入離心管B中，室溫下12000rpm離心8～12min，棄上清，取沉淀；

2、病菌裂解：在收集到的沉淀中加入50μL?Buffer?A，混勻，稍離心；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μL?Buffer?B，混勻；稍離心后靜置備用；所述Buffer?A為100mM?NaOH與2％Tween?20水溶液的混合液；Buffer?B為100mM?Tris-Hcl與2mM?EDTA水溶液的混合液；

3、模板PCR檢測(cè)和電泳成像；PCR檢測(cè)和電泳成像采用常規(guī)技術(shù)。

Buffer?A是裂解液，通過(guò)NaOH堿性裂解RSD病菌；Buffer?B是中性溶液，平衡裂解后溶液的pH值。

本發(fā)明專利的有益效果是，可以快速裂解甘蔗RSD病菌，釋放基因組DNA，操作簡(jiǎn)單、方便，不影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，而且試劑價(jià)格便宜、無(wú)毒，通過(guò)對(duì)一定甘蔗樣品蔗汁病菌的裂解，然后PCR檢測(cè)，驗(yàn)證了本發(fā)明具備了較高的靈敏性和準(zhǔn)確性，與常規(guī)CTAB法相比，PCR反應(yīng)的靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí)，且具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)污染的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是兩種不同甘蔗RSD病菌裂解方法的PCR檢測(cè)靈敏度比較圖。

具體實(shí)施方式

為了充分公開(kāi)本發(fā)明甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測(cè)方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。

實(shí)施例：甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測(cè)方法，具體步驟如下：

1、提取蔗汁

用帶槽錐子在甘蔗的基部節(jié)間取蔗汁1mL，放入1.5mL的離心管中，室溫下3000rpm離心5min。取上清液350μL放入新的1.5mL的離心管中，室溫下12000rpm離心10min，棄上清。

2、病菌裂解

在收集到的沉淀中加入50μL?Buffer?A，混勻，3000rpm離心5秒；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μL?Buffer?B，混勻，3000rpm離心5秒，置-20℃冰箱內(nèi)備用。

3、PCR擴(kuò)增：

用于甘蔗RSD病菌檢測(cè)的引物為：

Lxx?1：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3’

Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’

PCR體系：

ddH₂O??????????????????????????9.2μL

10×PCR?Buffer(Mg²⁺plus)???????2μL

dNTP(2.5mM)????????????????????1.6μL

Lxx1(10pm/μL)?????????????????1μL

Lxx2(10pm/μL)?????????????????1μL

BSA(1％)???????????????????????2μL

PVP(100mg/mL)??????????????????2μL

模板DNA????????????????????????1μL

Taq酶(5U/μL)??????????????????0.2μL