[發明專利]單花粉全基因組擴增庫的快速制備方法

無效

• 申請號: 200810071435.X
• 申請日: 2008-07-23
• 公開（公告）號: CN101328491A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 陳平華;高三基;陳由強;許莉萍;陳如凱;徐景升;郭晉隆;張華;王恒波;蔡瀾峰;潘永保
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及單花粉全基因組擴增庫的制備方法，尤其涉及單花粉全基因組擴增庫的快速制備方法、試劑配方及技術，實現單個植物性細胞遺傳物質的多次分析。

背景技術

花粉是植物的性細胞，其遺傳分離規律直接決定了雜種一代的性狀表現。單花粉PCR檢測技術已經在幾個物種上成功，但由于單個花粉分離和裂解的困難，以及單花粉只含痕量遺傳物質，PCR檢測只能做一次，不能重復檢測，限制了現有分子生物學技術在單花粉遺傳分析和染色體制圖上的應用。而要對花粉進行分子遺傳分析，如分子標記，則需要對同一個單花粉進行不同引物、多次PCR反應，由于單個花粉只含有痕量的DNA，進行一次PCR反應尚且困難，更不用說進行多次PCR檢測。現有研究尚停留在如何進行單個花粉PCR反應。如能將單個花粉粒分離、裂解并進行全基因組復制擴增，將單個花粉的DNA放大到上百萬倍，則問題就會迎刃而解。全基因組擴增技術(Whole?Genome?Amplification，WGA)是近年來發展起來的新型DNA復制技術，它提供了一種從微量基因組DNA獲取大量遺傳信息的途徑，在人類遺傳分析方面應用較多(Blanco?et?al.1989；Zhang?et?al.1992；Esteban?et?al.1993)，尤其為法醫處理微量檢材提供了一個有用的工具，有關技術方面的詳細信息可訪問西格瑪(SIGMA)公司全基因組擴增技術專業網站http://www.sigmaaldrich.com/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Whole_Genome_Amplification.html。利用全基因組擴增技術(WGA)制備單花粉全基因組擴增庫以實現對植物生殖細胞的遺傳分析，國內外尚沒有同類研究報道。

通過花粉粒群體研究親本的遺傳規律，關鍵在于建立單花粉PCR方法和實現單花粉的多次分子檢測。由于花粉粒作為單倍體細胞本身只含有微量的DNA，比常規PCR方法利用的模板含量低得多，所以單花粉PCR是一個限制因子；花粉粒非常小，又相互粘連，使得分離單花粉粒成為另一個限制因子。另外，自然條件下花粉粒在花粉囊裂解后只能存活幾分鐘(Fritz?and?Lukaszewski?1989；Khatun?and?Flowers?1995；Luna?et?al.2001)。因此基于花粉活性的研究，取樣和遺傳分析的效率顯得很重要。目前，應用于花粉粒的PCR檢測技術還主要停留在PCR技術的驗證性研究方面，少數幾種植物的單花粉PCR檢測技術基本建立(Aziz?and?Sauve?2003；Li?et?al.1990；Matsunaga?et?al.1999；Parducci?et?al.2005；Petersen?et?al.1996；Zhang?etal.1992)，但一粒花粉只能檢測一次，不能重復使用；花粉數量小，最多的一例只有60粒(Aziz?et?al.2005)。可見，當前有關單個花粉分子檢測技術還無法實現對單個花粉進行分子遺傳分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種單花粉全基因組擴增庫的快速制備方法，單花粉分離裂解后，即可直接進行WGA擴增，利用Phi29DNA聚合酶(Phi29DNApolymerase)的高保真全基因組DNA復制活性擴增產生大量的全基因組DNA，為植物單倍體細胞遺傳分析提供大量DNA模板。該方法能應用于大批量單花粉收集并制備足量全基因組DNA，為分析植物單倍體性細胞遺傳規律和通過單倍體染色體制圖創造首要條件。

本發明的一種單花粉全基因組擴增庫的快速制備方法，其特征在于由以下步驟組成；

1、滴1-2滴染色液在載玻片上備用；將供試作物的花藥浸入染色液中，在顯微鏡下用鑷子分離，取單個完整、干凈、未開裂的花藥，然后用鑷子挑破花粉囊壁，釋放出花粉粒；染色后，將染色液排凈，用30mM滅菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整個操作過程在無菌環境中進行；所述染色液組成成分為0.7mM苯胺磷酸氫二銨藍和30mM蔗糖的水溶液；所述花粉粒的直徑≥0.01mm；所述鑷子為顯微解剖鑷子DUMONT?No.11254-20。