[發明專利]菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 200810071154.4
• 申請日: 2008-05-30
• 公開（公告）號: CN101285104A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發明（設計）人: 沈建國;郭瓊霞;黃可輝;虞赟;王念武
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司
• 代理人: 丁秀麗

技術領域

本發明涉及一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它屬于生物技術領域，專用于口岸檢驗檢疫和農業植檢部門等對大豆上菜豆莢斑駁病毒的快速檢測。

背景技術

菜豆莢斑駁病毒(BPMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)、豇豆花葉病毒屬(Comovirus)成員，病毒基因組為二分體線形正義單鏈RNA，RNA-1長約6kb，RNA-2長約3.6kb。BPMV最早是1948年報道于美國查爾斯頓的菜豆Tendergreen品種上，現主要分布于北美地區，在美國的阿肯色州、北卡羅來納州、維吉尼亞州、肯塔基州、密西西比州、路易斯安那州、愛荷華州、伊利諾斯州和印地安那州等大豆種植地區分布廣泛。除美國外，近年來加拿大、巴西、秘魯也已有BPMV在大豆上發生的報道。菜豆莢斑駁病毒侵染大豆引起的菜豆莢斑駁病，不僅影響大豆的正常生長，引起產量損失，還使大豆種子質量明顯下降。據統計，BPMV侵染大豆造成的產量損失范圍為3％-52％，侵染時間越早，損失越嚴重，若與大豆花葉病毒(Soybean?Mosaic?Virus，SMV)復合侵染，則大豆產量損失可高達85％，給大豆生產帶來嚴重威脅。此外，BPMV侵染大豆后，還可導致大豆更易受到擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌的危害，致使大豆種子品質進一步降低。BPMV作為危險性有害生物，已被正式列入我國新增進境植物檢疫性病毒名錄。迄今為止，我國尚未見BPMV發生的報道，但隨著我國對外貿易和大豆加工業的的迅速發展，每年從國外(特別是美國)進口大量大豆，BPMV隨進口大豆傳入的風險越來越大。為避免BPMV傳入我國，給我國農業生產，特別是大豆種植業帶來巨大危險，迫切需要加強對BPMV的口岸檢疫，因此提高該病毒檢測技術具有極其重要的現實意義。

當前，用于植物病毒檢測的方法主要包括生物學檢測、電鏡檢測、血清學檢測和分子生物學檢測。通過接種指示植物可以檢測BPMV，該病毒接種大豆、菜豆Tendergreen后產生斑駁癥狀，而接種菜豆Pinto和Bountiful品種后產生局部枯斑，但該方法檢測時間長，并且結果易受人為因素和環境條件的影響。電鏡觀察由于需要昂貴的儀器和專門的操作人員，并且材料前處理較為復雜，因此在BPMV的快速檢測上具有較大局限性。血清學檢測具有所需設備簡單、操作簡便、成本低廉和反應靈敏的優點，目前已成為BPMV最常用的檢測方法，但該方法的使用前提是需要有價格昂貴、特異性強的抗血清。與血清學檢測方法相比，基于核酸水平的RT-PCR分子檢測方法具有靈敏度更高、特異性更強、結果更可靠等優點，國內外已有多篇關于利用RT-PCR方法檢測BPMV的研究報道，包括普通RT-PCR、免疫捕獲巢式RT-PCR和半巢式RT-PCR等(Gu等，Phytopathology，2002，92(4)：446～452；于翠等，植物檢疫，2006，20(4)：201～204；聞偉剛等，植物病理學報，2006，36(4)：296～300)。但是，至今尚未見應用TC-RT-PCR(試管捕捉RT-PCR)技術檢測BPMV的報道，更未見專門用于檢測BPMV的TC-RT-PCR檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的是提供一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它可對口岸進境大豆種子及田間大豆上菜豆莢斑駁病毒進行快速、準確、有效的檢疫鑒定。

本發明技術方案由以下兩部分構成：

(一)一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特征在于其組成為：

(1)1^#液，含有病毒抽提試劑：PBS緩沖液，濃度1×，pH7.4；

(2)2^#液，含有菜豆莢斑駁病毒上游引物：5’-GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3’，濃度10μmol/L；

(3)3^#液，含有菜豆莢斑駁病毒下游引物：5’-GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3’，濃度10μmol/L；

(4)4^#液，含有RT?Buffer，濃度5×；

(5)5^#液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/μL；

(6)6^#液，含有反轉錄酶，濃度200U/μL；

(7)7^#液，含有dNTPs，濃度10mmol/L；

(8)8^#液，含有PCR?Buffer，濃度10×；

(9)9^#液，含有Mgcl₂，濃度25mmol/L；