[發(fā)明專利]一種蛇毒抗腫瘤的細(xì)胞毒素及其生產(chǎn)工藝

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810071055.6
• 申請(qǐng)日: 2008-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN101270159A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許云祿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C07K1/18;C07K1/20;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說是一種蛇毒細(xì)胞毒素及其生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)

細(xì)胞毒素的分離純化最早是在1947年由印度學(xué)者用鹽析法(Na₂SO₄和NaCl)從印度眼鏡蛇毒中分離得到的；接著Ravdonat?and?Holler用紙層析法；Braganca等經(jīng)CM-cellulose離子交換層析、Sephadex?G-50凝膠過濾等步驟分離出CytotoxinP₆；杜雨蒼等用SP-Sephadex?C-25陽離子交換層析從中華眼鏡蛇毒中分離出5個(gè)細(xì)胞毒素。但隨著對(duì)細(xì)胞毒素研究的深入，許多學(xué)者注意到采用傳統(tǒng)的分離方法會(huì)出現(xiàn)痕量的磷脂酶A₂(PLA₂)(0.1～0.5％，w/w)與CTX共同洗脫下來，而PLA₂與CTX會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，可使CTX的溶血作用顯著增強(qiáng)，也可使它的細(xì)胞毒性增加數(shù)倍，嚴(yán)重干擾了對(duì)CTX的生物學(xué)活性及其作用機(jī)制的研究，因此分離得到不含PLA₂的CTX很重要。Hodges等介紹了一種新的從眼鏡蛇毒中分離純化細(xì)胞毒素同系物的方法：(1)粗毒過Sephadex?G-50凝膠過濾柱去除大分子雜蛋白，得主要毒素峰；(2)主峰過SP-Sephadex?C-25陽離子交換層析，線性梯度洗脫得一系列蛋白峰；(3)主峰再過反相高效液相(RP-HPLC)。這種方法對(duì)去除痕量磷脂酶A₂很有效，同時(shí)也保留了CTX的全部生物學(xué)活性。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細(xì)胞毒素純品及其生產(chǎn)工藝。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細(xì)胞毒素，其特征是：取之于現(xiàn)有眼鏡蛇毒凍干粉。

所述的眼鏡蛇毒凍干粉是未經(jīng)雙蒸水溶解的。

一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細(xì)胞毒素生產(chǎn)工藝，其特征是：

1)去雜質(zhì)的眼鏡蛇毒凍干粉未經(jīng)適量的雙蒸水溶解后，上SP?Sepharose?HighPerformance陽離子交換柱層析，得20個(gè)蛋白峰(I-XX)，收集具有細(xì)胞毒素活性的XII、XIII峰。

2)收集具有細(xì)胞毒素活性的XII、XIII峰分別上經(jīng)Source?30RPC反相層析，分別得到主蛋白峰一個(gè)，即細(xì)胞毒素XII和細(xì)胞毒素XIII。

所述的SP?Sepharose?High?Performance(GE?Healthcare公司產(chǎn)品)。

所述的Source?30RPC(GE?Healthcare公司產(chǎn)品)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的生產(chǎn)工藝第1步驟與現(xiàn)有技術(shù)不同的是選用高分辨率快速陽離子交換介質(zhì)SP?Sepharose?H.P，在蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，因而獲得高分辨率的分離效果，故可獲得20個(gè)蛋白峰，而使用現(xiàn)有技術(shù)工藝最多獲得15個(gè)蛋白峰；在蛋白純化系統(tǒng)用SPSepharose?H.P分離蛋白質(zhì)不僅分辨率極高，而且有良好的重復(fù)性和工藝放大能力。本發(fā)明的第2步驟選用高速低反壓高分辨率Source?30RPC介質(zhì)，獲得高分辨率精細(xì)純化效果，第1步驟獲得的細(xì)胞毒素組分經(jīng)第2步純化即獲得不含PLA₂的細(xì)胞毒素純品，比現(xiàn)有技術(shù)純化步驟具有快速重復(fù)性好，適合放大生產(chǎn)。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明：

圖1為蛇毒經(jīng)SP-Sepharose?H.P陽離子交換柱層析圖譜。

圖中眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)SP-Sepharose?H.P陽離子交換色譜分離得到20個(gè)蛋白峰，分別記為I、II、III、IV、V、VI、IVI、VII?I、IX、X、XI、XI?I、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVII、XIX和XX。測(cè)定各洗脫峰對(duì)大鼠離體心臟和離體隔神經(jīng)隔肌標(biāo)本的影響的影響，發(fā)現(xiàn)組分XI、XII、XIII和XIV具有抑制心臟收縮幅度，使心臟停于收縮期，能抑制直接刺激膈肌引起的收縮，初步鑒定為細(xì)胞毒素組分。

圖2和圖3為具有細(xì)胞毒活性蛋白峰經(jīng)Source30?RPC反向?qū)游鰣D譜。

將XII、XIII用Source30?RPC柱進(jìn)一步純化，各得到主蛋白峰1個(gè)，分別記為CTX-XII和CTX-XIII。經(jīng)鑒定他們均具有殺傷腫瘤細(xì)胞作用。

其中：圖2為Source?30RPC反相層析純化CTX-XII；

圖3為Source?30RPC反相層析純化CTX-XIII。