[發明專利]用于小型動物肝臟淋巴細胞分離的肝臟灌注方法

無效

• 申請號: 200810069978.8
• 申請日: 2008-07-14
• 公開（公告）號: CN101329227A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 趙韌;倪兵;吳玉章;王慶紅;賈正才;王靖雪;李健;石晶磊;黃澤民;田易;田志強;沈小麗
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N33/48;A61B19/00;C12Q1/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及醫學領域，特別涉及用于小型動物肝臟淋巴細胞分離的肝臟灌注方法。

背景技術

正常的肝組織由動脈和門靜脈供血，其中70％-85％的供血來源于門靜脈。門靜脈收集來自胃、小腸、大腸(直腸后部除外)，胰和脾的血液，經肝門入肝，在肝內反復分支匯入竇狀隙，最后集合為數支肝靜脈匯入后腔靜脈。

肝臟淋巴細胞與肝臟疾病關系密切，可能參與了肝炎、肝硬化、肝癌等諸多肝臟疾病的發生與發展，此外，與自身免疫性疾病和器官移植免疫等也有一定關系。要深入研究肝臟淋巴細胞在上述疾病中的表型變化和意義，前提是要建立有效的肝臟淋巴細胞分離方法。影響肝臟淋巴細胞分離的因素較多，其中肝臟的預處理最為重要。國外常用門靜脈肝灌注法以排除過客淋巴細胞的影響，但是該技術較難操作，特別是當實驗動物為小鼠等體型較小的動物時，由于其門靜脈很細，解剖結構位置較深，需仔細剝離周圍韌帶，操作難度很大，而且穿刺針不易固定，容易脫落和刺破門靜脈，經常會出現穿刺針刺入小葉分支靜脈而導致各葉肝產生大小不等的盲區(即有血液殘留的區域)的情況，由此造成循環血液排除不充分，后續分離得到的肝臟淋巴細胞中混雜有過客淋巴細胞，從而對實驗結果的準確性造成明顯影響；此外，門靜脈肝灌注法還需要恒流泵等灌流裝置以及外科顯微鏡等，操作比較繁瑣、耗時。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種用于小型動物肝臟淋巴細胞分離的肝臟灌注方法，可以克服門靜脈肝灌注法在小鼠等小型實驗動物體上操作時存在的缺陷，適用于小型實驗動物的肝臟淋巴細胞分離，可以充分排除肝內循環血液以避免過客淋巴細胞的干擾，同時操作簡便、快速、成本低。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

用于小型動物肝臟淋巴細胞分離的肝臟灌注方法，將動物處死后，經后腔靜脈進行肝臟灌注。

進一步，所述肝臟灌注方法是將動物脫頸處死后，消毒，解剖腹部，暴露后腔靜脈，將穿刺針自后腔靜脈遠端刺入，緩慢注入灌注液至可見肝臟表面毛細血管網，肝臟由深紅色褪色至無灌注盲區為止。

本發明的有益效果在于：

本發明的肝臟灌注方法與門靜脈肝灌注法比較，具有如下優點：(1)由于后腔靜脈較門靜脈粗，分離及穿刺操作非常簡單，操作時間比門靜脈肝灌注法縮短近1小時；(2)遠離門靜脈進行充分灌注，循環血液排除充分，可以避免未灌注完全的盲區的存在；(3)可以普通的小兒頭皮針及一次性注射器替換恒流泵等灌流裝置，可克服恒流泵安裝復雜、間斷性灌流的缺點，而且降低實驗成本，簡化操作步驟。研究證明，本發明的肝臟灌注方法能夠達到理想的肝灌注效果，適合于大多數實驗室在進行小鼠等小型動物肝臟淋巴細胞分離時采用，具有良好的推廣應用價值。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中：

圖1為小鼠門靜脈和后腔靜脈解剖示意圖；

圖2為小鼠灌注前的肝臟解剖示意圖；

圖3為小鼠經后腔靜脈肝灌注后的肝臟解剖示意圖；

圖4為經后腔靜脈肝灌注后分離出的小鼠完整肝臟；

圖5為經門靜脈肝灌注后分離出的小鼠完整肝臟。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

本發明的用于小型動物肝臟淋巴細胞分離的肝臟灌注方法，以已經死亡的動物為實施對象，經后腔靜脈進行灌注。

本實施例是將Balb/c小鼠脫頸處死后，用濕潤的酒精棉球擦身消毒，解剖腹部，將胃腸移向左側，暴露后腔靜脈，將接有一次性注射器(體積為15ml)的4號小兒頭皮針自后腔靜脈遠端刺入，并用眼科彎鑷夾住以固定，緩慢注入預冷的Hank’s平衡鹽溶液至可見肝臟表面毛細血管網為止，實驗過程中可見肝臟逐漸膨脹，并由深紅色逐漸褪色，最后整個肝臟呈均勻土黃色，基本無盲區存在。

參見圖1-圖5，圖1為小鼠門靜脈和后腔靜脈解剖示意圖，從圖可知，門靜脈為分支靜脈，很細，且解剖位置較深(圖中是將肝臟貼向膈面以暴露肝底)，故懸空穿刺且視野較暗，操作極為不便；而后腔靜脈為主靜脈，很粗淺，將腸管翻向右側即可見，且其緊貼腹后壁，穿刺固定非常容易；圖2為小鼠灌注前的肝臟解剖示意圖，可見小鼠灌注前的肝臟呈深紅色；圖3為小鼠經后腔靜脈肝灌注后的肝臟解剖示意圖，可見小鼠灌注后的肝臟呈均勻土黃色；圖4為經后腔靜脈肝灌注后分離出的小鼠完整肝臟，可見各葉肝均灌注良好，無盲區存在；圖5為經門靜脈肝灌注后分離出的小鼠完整肝臟，方框所指區域即為未灌注完全的盲區。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。