[發(fā)明專利]一種中和腸出血性大腸桿菌0157：H7志賀毒素Ⅱ的單克隆抗體、Fab抗體與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810069787.1
• 申請日: 2008-05-30
• 公開（公告）號: CN101357942A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒全明;羅萍;曾浩;毛旭虎;石云;張衛(wèi)軍;劉璐
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/13;C12N5/18;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A61K39/395;A61P31/04
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及中和腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素II的單克隆抗體、Fab抗體及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7的感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。其引發(fā)的食物中毒在世界各地均有大規(guī)模的暴發(fā)流行。2006年在美國爆發(fā)的波及26個州的毒菠菜事件就是由該菌污染所致，1999年末至2000年初，在我國東部部分地區(qū)發(fā)生了迄今為止世界上最大規(guī)模的O157:H7感染爆發(fā)流行。由于該菌培養(yǎng)容易、感染力強、傳播途徑多樣，使其極有可能作為未來軍事斗爭的細(xì)菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑。美國疾病控制中心(CDC)已將EHECO157菌列為B類生物恐怖病原體嚴(yán)加防范。此外，EHEC?O157:H7菌的烈性致病因子還有可能用于新型生物武器——基因武器的構(gòu)建。?

然而目前對其感染尚缺乏有效的防治方法。研究證明：抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Shigatoxin，Stx)，從而使患者病情加重。因此，無論從公共衛(wèi)生還是生物反恐的需要出發(fā)，探索新的治療手段迫在眉睫。?

研究表明：志賀毒素II(Stx2)是O157:H7主要的致病因子。Stx2進(jìn)入血液循環(huán)后，可引起靶組織器官，如腎小球和結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。Stx2致病是急劇快速的，因此針對Stx2的中和性抗體在O157:H7感染的緊急治療中將發(fā)揮重要作用，但目前國內(nèi)外尚無Stx2中和性抗體上市。?

由于鼠源單抗可在人體內(nèi)引起人抗鼠抗體反應(yīng)；完整的單抗分子量大，組織攝取百分?jǐn)?shù)較低，體內(nèi)半衰期較長，因而使其在人體內(nèi)的應(yīng)用受到限制。基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展使人們可以在基因水平上改造抗體結(jié)構(gòu)，以滿足用于人體治療的抗體需低免疫原性、高特異性、高穩(wěn)定性、和高親和力的要求。對鼠源性抗體進(jìn)行人源化改造，或構(gòu)建主要保留抗體可變區(qū)的小分子抗體，如Fab及ScFv，既可降低分子量亦可降低異源性，同時還保留有抗原結(jié)合活性，將有利于鼠單抗在人體內(nèi)應(yīng)用。Fab抗體保留了全抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)及第一恒定區(qū)(VH+CH1)，分子量僅為全抗體的三分之一，大大降低了抗體的鼠原性。與SeFv抗體相比，F(xiàn)ab抗體在體內(nèi)半衰期較長、穩(wěn)定性好、保留了與親代抗體較為接近的親和力，這對發(fā)揮中和毒素作用的治療性抗體而言尤為重要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種中和腸出血性大腸O157:H7的志賀毒素II的單克隆抗體，其由保藏在以下單位的雜交瘤細(xì)胞株制備：保持單位為中國典型培養(yǎng)物保持中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏日期為2008年5月27日，保藏號為CCTCC：C200822，雜交瘤細(xì)胞體系為1F2。?

本發(fā)明的另外一個目的是提供上述的單克隆抗體制得的Fab抗體，其包括κ鏈和Fd鏈。?

所述的κ鏈具有SEQ?ID?NO：1所述的氨基酸序列或?qū)⑺鯯EQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一種。?

所述的κ鏈的核苷酸序列具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列或與所述SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列不同但具有相同編碼產(chǎn)物的核苷酸序列中的任一種。?

所述的Fd鏈具有SEQ?ID?NO：3所述的氨基酸序列或?qū)⑺鯯EQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一種。?

所述的Fd鏈的核苷酸序列具有SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列或與所述SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列不同但具有相同編碼產(chǎn)物的核苷酸序列中的任一種。?

本發(fā)明提供上述的Fab抗體的制備方法，其主要包括以下步驟：?

1)提取所述雜交瘤細(xì)胞的總RNA，獲得RNA；?

2)以步驟1)中的RNA為克隆模板，克隆所述單克隆抗體的κ鏈和Fd鏈基因；?

3)將步驟2)獲得的κ鏈和Fd鏈基因克隆到T載體中，進(jìn)行鑒定；?

4)將步驟3)獲得的κ鏈和Fd鏈基因克隆到分泌表達(dá)Fab抗體的載體中，進(jìn)行表達(dá)、鑒定、純化，得所述的的Fab抗體。?

本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，其含有上述的κ鏈和Fd鏈的核苷酸序列。?

本發(fā)明所述的表達(dá)載體，可以包括裸DNA或質(zhì)粒DNA中的至少一種。?