[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細(xì)胞接種方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810069602.7
• 申請(qǐng)日: 2008-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN101285052A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃博;李長青;周躍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/06
• 分類號(hào): C12N5/06;C12N5/08;A61L27/38
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所
• 代理人: 康海燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織工程椎間盤髓核的構(gòu)建技術(shù)，具體涉及應(yīng)用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細(xì)胞接種方法。

背景技術(shù)

在組織工程椎間盤髓核的構(gòu)建過程中，種子細(xì)胞的接種是一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，接種方法的選擇直接影響著種子細(xì)胞在支架材料上分布、上架率及細(xì)胞的生物學(xué)活性，進(jìn)而決定所構(gòu)建組織的生物學(xué)功能。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的種子細(xì)胞的接種方法很多，其中以靜置法最為常用，該方法簡單易行，但此法存在的最大問題是細(xì)胞的上架率很低，并且所接種細(xì)胞在支架材料中的分布不均勻。于是研究者又嘗試使用動(dòng)態(tài)接種法進(jìn)行接種，其中包括perfusion?seeding(灌注接種法)，spinner?flask?seeding(旋轉(zhuǎn)接種法)，agitated?seeding(攪動(dòng)接種法)等，但是這些方法的效率目前仍然存在爭論，并且需要借助特殊的設(shè)備。此外，其他接種方法，例如oscillating?perfusion(振蕩接種法)，filtrationseeding(過濾接種法)等操作比較復(fù)雜，且多受限于材料的形狀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種應(yīng)用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細(xì)胞接種方法，其方法簡單，并能提高種子細(xì)胞的上架率和種子細(xì)胞在支架內(nèi)分布的均勻程度。

本發(fā)明提出的應(yīng)用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細(xì)胞接種方法，采用的種子細(xì)胞接種載體為透明質(zhì)酸，該載體為正常椎間盤髓核的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在整個(gè)髓核組織空間結(jié)構(gòu)的維持，髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定，髓核細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮等方面起著關(guān)鍵的作用。

本發(fā)明方法的步驟如下：

一種應(yīng)用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細(xì)胞接種方法，所述方法采用的種子細(xì)胞接種載體為透明質(zhì)酸，其步驟如下：

(1)首先將人或動(dòng)物的椎間盤髓核細(xì)胞與用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液配制的透明質(zhì)酸溶液進(jìn)行混懸，保證細(xì)胞懸液中髓核細(xì)胞的終濃度為1×10⁵-1×10⁶個(gè)/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0.001-0.01mg/ml；

(2)將本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織工程髓核支架材料用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡后吸干水分，放入培養(yǎng)皿中待用；

(3)將步驟(1)所制的細(xì)胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37℃，5％CO₂的孵箱內(nèi)靜置；

(4)30分鐘后將細(xì)胞-支架復(fù)合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2-3日進(jìn)行換液，直到細(xì)胞在支架材料內(nèi)進(jìn)行增殖并合成細(xì)胞外基質(zhì)，此時(shí)將細(xì)胞-支架復(fù)合體移植入動(dòng)物或人體內(nèi)進(jìn)行研究或治療。

應(yīng)用上述種子細(xì)胞接種方法具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：

1.透明質(zhì)酸為正常髓核組織基質(zhì)成分，具有可降解性，無免疫原性，不激活補(bǔ)體和促進(jìn)種子細(xì)胞更好發(fā)揮生物學(xué)功能等特點(diǎn)，因而此接種方法更加的安全、仿生并且可以提高所構(gòu)建組織的生物學(xué)性能。

2.此種方法操作簡單，無需借助特殊的設(shè)備，只需將種子細(xì)胞與一定濃度的透明質(zhì)酸混懸后滴注到本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織工程髓核支架材料上靜置即可。

3.以往研究證明透明質(zhì)酸是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附以及細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上伸展的重要分子，因而此基于透明質(zhì)酸作為接種載體的接種法可以提高種子細(xì)胞的上架率和種子細(xì)胞在支架內(nèi)分布的均勻程度。

4.透明質(zhì)酸為正常髓核基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性，因而此接種方法在組織工程髓核研制領(lǐng)域當(dāng)中可以廣泛應(yīng)用。

5.所應(yīng)用的透明質(zhì)酸價(jià)格便宜，因而此種方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于推廣使用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1.首先將分離培養(yǎng)的三周齡新西蘭乳兔椎間盤髓核細(xì)胞與用DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)配制的透明質(zhì)酸溶液進(jìn)行混懸，保證細(xì)胞懸液中髓核細(xì)胞的終濃度為1×10⁵-1×10⁶個(gè)/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0.001-0.01mg/ml。

2.將I型膠原海綿支架材料用DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)浸泡后盡量吸干水分，放入培養(yǎng)皿中待用。

3.將第1步所制的細(xì)胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37℃，5％CO₂的孵箱內(nèi)內(nèi)靜置。