[發(fā)明專(zhuān)利]一種植物生長(zhǎng)素調(diào)控的啟動(dòng)子及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810069226.1
• 申請(qǐng)日: 2008-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101260405A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李正國(guó);王心宇;楊迎伍;鄧偉;宋紅麗;孟德?tīng)枴げ紳梢?/a>
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/29
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/29;C12N15/82;C12N5/10;A01H1/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及到分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域中一種從番茄中分離出來(lái)的、受生長(zhǎng)素調(diào)控的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物是一個(gè)多細(xì)胞組成的復(fù)雜有機(jī)體，要維持正常協(xié)調(diào)的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)、適應(yīng)外界環(huán)境，各細(xì)胞、組織和器官之間必須及時(shí)進(jìn)行有效的信息交流。擔(dān)負(fù)這種信息交流任務(wù)的化學(xué)信使之一就是植物激素。因此，植物激素及其作用機(jī)制是植物學(xué)研究的核心領(lǐng)域之一。

生長(zhǎng)素是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物激素，在植物發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在莖切段實(shí)驗(yàn)和胚芽鞘實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出刺激細(xì)胞生長(zhǎng)伸長(zhǎng)的作用，它的主要生理作用還包括誘導(dǎo)不定根發(fā)生、促進(jìn)微管束分化、控制向性生長(zhǎng)和頂端優(yōu)勢(shì)，以及調(diào)節(jié)植物開(kāi)花坐果等生理過(guò)程。近20年來(lái)的研究已經(jīng)清楚地證明，生長(zhǎng)素還在分子水平對(duì)基因表達(dá)起著特殊的快速調(diào)控作用。生長(zhǎng)素調(diào)控基因表達(dá)的方式一直是植物分子生物學(xué)的重要研究熱點(diǎn)。特別是那些在幾分鐘內(nèi)便可被生長(zhǎng)素特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因，稱(chēng)為早期基因或原初響應(yīng)基因研究較為深入。

目前，多個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的啟動(dòng)子(如大豆GH3、SAUR15A和豌豆PS-IAA4/5)已通過(guò)不同方法(如缺失分析、接頭掃描、定點(diǎn)突變和增益分析)詳細(xì)分析。對(duì)啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，Aux/IAAs和其他生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子中都含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，即生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(AuxRE)。最常見(jiàn)的生長(zhǎng)素響應(yīng)原件是一個(gè)六堿基保守序列：TGTCTC，它是Aux/IAAs與生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(ARF)特異性結(jié)合的位點(diǎn)。

天然AuxREs啟動(dòng)子-報(bào)告基因構(gòu)建可用于研究生長(zhǎng)素應(yīng)答基因在組織和器官的表達(dá)模式。這些構(gòu)建體是跟蹤基因在與生長(zhǎng)素梯度或靈敏度變化有關(guān)的生長(zhǎng)反應(yīng)，(如向地性和向光性等)中的表達(dá)事件的有力工具，也是研究植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑的手段。AuxRE-報(bào)告基因復(fù)合體在許多種類(lèi)的器官、組織和細(xì)胞中都表現(xiàn)出對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)。

通過(guò)差異顯示PCR法從番茄果實(shí)中分離出果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因(development?regulationDR)。通過(guò)同源序列分析得出：DR1、3、4、8屬于Aux/IAAs基因家族，DR12屬于ARF基因家族。到目前為止，研究得比較清楚的是DR12和DR4。研究結(jié)果表明：在果實(shí)中，DR1、3、4、8的表達(dá)受到乙烯的調(diào)控，而在葉片中則沒(méi)有這種情況，表明這些基因在特定組織(果實(shí))中的表達(dá)受到乙烯的調(diào)控，它們可能與果實(shí)發(fā)育相關(guān)。

經(jīng)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，DR8在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)，但在果實(shí)成熟過(guò)程中(轉(zhuǎn)色期)其表達(dá)水平迅速下降；該基因的表達(dá)水平受到乙烯的負(fù)調(diào)控和生長(zhǎng)素的正調(diào)控，綠熟期果實(shí)經(jīng)50μM乙烯處理后表達(dá)水平迅速降低，果實(shí)經(jīng)10μM?2，4-D處理后，表達(dá)增強(qiáng)。DR8作為一個(gè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)表達(dá)的基因，但卻強(qiáng)烈地受到乙烯和果實(shí)成熟的調(diào)節(jié)，預(yù)示著該基因不僅對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程具有重要的調(diào)控作用，并且可能和生長(zhǎng)素與乙烯的相互作用密切相關(guān)。

目前，DR8已被成功轉(zhuǎn)入番茄中，但對(duì)該基因的功能的了解，目前還只是來(lái)源于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的表型分析的一些初步推測(cè)，因此研究該基因啟動(dòng)子的調(diào)控特征是十分有必要的。目前的研究證實(shí)，在DR8基因的啟動(dòng)子中含有一個(gè)類(lèi)似乙烯響應(yīng)元件的序列，卻未發(fā)現(xiàn)與已知生長(zhǎng)素響應(yīng)元件類(lèi)似的序列。啟動(dòng)子片斷熒光表達(dá)載體在原生質(zhì)融合體中表達(dá)研究證實(shí)，該啟動(dòng)子確實(shí)受到生長(zhǎng)素誘導(dǎo)。因此，該啟動(dòng)子有可能含有新的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，研究該基因在組織和器官的表達(dá)模式，將為進(jìn)一步揭示生長(zhǎng)素對(duì)番茄生長(zhǎng)以育的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建DR8啟動(dòng)子-報(bào)告基因，是研究該基因在與生長(zhǎng)素有關(guān)的生長(zhǎng)反應(yīng)(如向地性和向光性等)中的表達(dá)調(diào)控方式的重要方法。另外，已有充足的證據(jù)表明，生長(zhǎng)素調(diào)控基因的表達(dá)也受其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響。因此，構(gòu)建DR8啟動(dòng)子-報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化模式植物，研究其表達(dá)的組織特異性和對(duì)生長(zhǎng)素及其它刺激條件(如乙烯、傷害等)的響應(yīng)特性，可以為進(jìn)一步揭示生長(zhǎng)素調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也可探討生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與其它信號(hào)的相互影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種植物生長(zhǎng)素調(diào)控的啟動(dòng)子及其應(yīng)用

本發(fā)明所提供的從番茄中分離的受植物生長(zhǎng)素調(diào)控的啟動(dòng)子DR8，它的核苷酸序列是序列表中序列1所述核苷酸，長(zhǎng)度為1031bp。

含有上述啟動(dòng)子的表達(dá)盒和重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無(wú)性系或其后代。