[發(fā)明專利]一種從瓊脂糖凝膠中回收DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810068623.7
• 申請日: 2008-01-22
• 公開（公告）號: CN101274952A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃海;馮發(fā)莉;劉楊;黃健
• 申請（專利權(quán)）人: 貴陽醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/06
• 代理公司: 貴陽中工知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所
• 代理人: 陳忠俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及一種回收純化DNA的方法，具體涉及一種從電泳后瓊脂糖凝膠中回收純化DNA的方法。

背景技術(shù)

在分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中，很多實驗都需要通過瓊脂糖電泳分離開DNA片段，再將需要的DNA條帶回收用于后續(xù)實驗，如DNA片段克隆、酶切分析、標(biāo)記、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase?chain?reaction，縮寫為PCR)以及體外轉(zhuǎn)錄等。瓊脂糖凝膠DNA的回收一直是分子生物學(xué)實驗的主要內(nèi)容，由于瓊脂糖凝膠是固體，包含在里面的DNA條帶不容易被釋放出來，故對其回收一直都需要多步操作。

在涉及DNA領(lǐng)域的中國發(fā)明專利申請有許多，申請?zhí)枮?00610037351.5，發(fā)明名稱為《從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法》的方法，介紹了從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法，它依次包括以下步驟：用dH2O清洗膠條樣品、以凝膠研磨棒研磨凝膠至成粉狀、凝膠浸泡、凝膠去除、DNA連接、DNA吸附、DNA洗滌、DNA洗脫等。據(jù)介紹該發(fā)明的優(yōu)點是①DNA回收量大，純度高。②操作時間短，操作簡單。③不需要特殊設(shè)備，成本低廉。④可以制成試劑盒。⑤也可用于瓊脂糖凝膠的DNA回收。這也反映了現(xiàn)有回收瓊脂糖凝膠DNA的方法和試劑盒，最常用的是從瓊脂糖凝膠上將目的DNA條帶切割下來，加入溶解溶液后加溫溶解，再過回收柱，達到純化的目的。其他常用方法還有用低熔點瓊脂糖法，DEAE-纖維素膜電泳法等，都需要不至一次的操作凝膠，如切膠或插入膜片，再電泳等。操作煩瑣，而且費時。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有方法，切膠回收的煩瑣操作和在操作多個樣品時易交叉污染的缺點，提供一種從電泳后的瓊脂糖凝膠中回收線性或環(huán)狀DNA的方法，該方法能在15min內(nèi)從瓊脂糖凝膠中回收純化目的DNA片段，且純度很高，能滿足后續(xù)的分子克隆、酶切分析、標(biāo)記和PCR等操作。

本發(fā)明的主要原理為：0.6％～2％的瓊脂糖凝膠機械強度很低，可很容易地將硬質(zhì)吸水海綿直接插入其中。同時瓊脂糖凝膠主要為水溶液，有高吸水性能的硬質(zhì)吸水海綿可迅速吸收充脹，在此過程中DNA也即與凝膠中溶液一并被吸收出來。通過高速離心可又將吸收的DNA溶液甩出該吸水海綿，達到將DNA從瓊脂糖凝膠中釋放出來的目的。

本發(fā)明是一種從電泳后的瓊脂糖凝膠中回收DNA的方法，依次包括如下步驟：

(1)吸水材料制備：將具有一定硬度的硬質(zhì)吸水海綿裁成3mm×3mm×10mm，下端為楔型的條狀物，并事先經(jīng)過消毒滅菌。

(2)樣品吸出：電泳后，在紫外燈照射下將制成楔型的強吸水材料條對準(zhǔn)目的DNA條帶插入凝膠中，待其吸收15～30秒后，可見發(fā)出熒光的DNA條帶被吸入其中，然后拔除。

(3)離心收集：將此吸水材料放入帶有漏斗的離心管中，以15000rpm速度離心3～4分鐘，即可將DNA溶液從中離心脫出來。

完成這3步所制得的DNA樣品就可用作PCR模板、酶切、分子克隆等實驗操作，若需進一步去除雜質(zhì)，可將回收DNA溶液采用如下純化操作步驟：

(4)DNA吸附：將DNA回收柱放置在離心管中，將離心收集溶液移入回收柱純化膜上，室溫下放置2分鐘，以10000～12000rpm速度離心1分鐘，棄離心管底部液體。

(5)DNA洗滌：在DNA回收柱中加入成份為10～20mmol/L?pH8.0的Tris(三羥甲基氨基甲烷)與無水乙醇為1∶2至1∶4混合的DNA洗滌液500～800μl，以10000～12000rpm速度離心1分鐘，棄離心管底部液體，重復(fù)操作1次。將DNA硅膠吸附柱重新放入離心管中，室溫10000～12000rpm離心2分鐘。

(6)DNA洗脫：將DNA回收柱移入一只新1.5ml離心管中，向DNA回收柱純化膜中央加入30～40μl預(yù)熱至37℃的TE溶液或用去離子水洗脫，在室溫下放置2分鐘，然后以12000rpm速度離心2分鐘，離心管底的液體即為瓊脂糖凝膠中回收的DNA溶液，可直接用于后續(xù)實驗，也可-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

一種從電泳后的瓊脂糖凝膠中回收DNA的方法，操作中采用硬質(zhì)吸水海綿用于從瓊脂糖凝膠中快速吸收出DNA樣品，帶漏斗的離心管利于高吸水材料吸收樣品被離心至底部，硬質(zhì)吸水海綿和帶漏斗的離心管為商業(yè)購得。DNA洗滌液用于沖洗掉DNA以外的雜質(zhì)成分，在含有約70％的乙醇時，洗滌過程中DNA不會溶解丟失，TE(是三羥甲基氨基甲烷加EDTA)溶液，或是用去離子水用于溶解DNA。