[發明專利]蛋白質穩定與生物活性保護多肽及其編碼基因、重組表達載體、表達菌及應用

無效

• 申請號: 200810067238.0
• 申請日: 2008-05-14
• 公開（公告）號: CN101280003A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 鄭易之;鄒永東
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C07K1/00
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司
• 代理人: 宋湘紅

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種蛋白質穩定與生物活性保護多肽及其編碼基因、重組表達載體、表達菌及應用。

背景技術

在現代生物科學、化學和醫學領域中，廣泛使用具有生物活性的各種蛋白質制劑。蛋白質制劑的存貯方式一般有液體和固體(干粉)兩種形式。第一種方式的蛋白質溶液由于在常溫下容易變性，降低或喪失生物活性，因此需要存放在低溫環境中，但在存貯和運輸過程中，可能由于各種原因導致其脫離低溫環境，造成蛋白質變性沉淀和生物活性降低。第二種方式是將蛋白質制劑成干粉，存放常溫下，但冷凍干燥過程中的冷凍和干燥所導致的脫水過程可對蛋白質造成損傷變性，導致生物活性降低。此外，在蛋白質溶液制劑的使用過程中，反復凍融會顯著降低蛋白質的生物活性。為了保持蛋白質的穩定性和保護蛋白質的生物活性，蛋白質制劑中往往加入了各種保護劑，例如：在蛋白酶溶液中加入血清蛋白和甘油等保護劑，血清蛋白可以防止蛋白酶發生由疏水相互作用引起的聚集和沉淀，甘油可以避免疏水作用引起的蛋白酶聚集，保護蛋白酶的生物活性。在蛋白質凍干制劑中加入了糖、多羥基化合物、血清蛋白、表面活性劑和氨基酸等各種保護劑，可與蛋白質表面的極性基團形成氨鍵，防止蛋白質在冷凍干燥過程中失水后氫鍵直接暴露于周圍環境中，減少蛋白質的損傷、變性和聚集。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種蛋白質穩定與生物活性保護多肽。

本發明的第二個目的在于提供一種本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽的編碼基因。

本發明的第三個目的在于提供一種本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽的重組表達載體。

本發明的第四個目的在于提供一種表達本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽的表達菌。

本發明的第五個目的在于提供本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽的應用。

植物胚胎發育晚期豐富蛋白是胚胎發生后期伴隨脫水過程在種子中大量積累的一系列蛋白質，一般分為6組，其中第1組蛋白具高親水性和熱穩定性。本發明人注意到第1組蛋白含有高度保守的20氨基酸序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所述，該20氨基酸序列主要由親水性氨基酸組成，含大量自由卷曲結構和左手擴展螺旋結構，本發明人推測該20氨基酸序列可防止高溫、干燥或冰凍引起的脫水及反復凍融對蛋白質的損傷和變性，保持蛋白質的穩定性和保護蛋白質的生物活性。本發明人將此20氨基酸序列命名為ZYZ20多肽，通過基因工程方法表達和獲得了含有2-8個ZYZ20多肽的多肽，加入到蛋白質液體制劑和蛋白質固體制劑中，可有效提高蛋白質在常溫條件下的穩定性，防止蛋白質在冷凍干燥過程的變性和失活，防止蛋白質在反復凍融過程中的失活，保護蛋白質的生物活性。

本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽，為如下(a)或(b)或(c)所述的多肽：

(a)ZYZ20多肽，它為序列表中SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列；

(b)由2-8個ZYZ20多肽首尾串聯而成的多肽，ZYZ20多肽之間由2-5個氨基酸連接起來；

(c)將(a)或(b)所述的多肽經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白質穩定與活性保護功能的由(a)或(b)衍生的多肽，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在ZYZ20多肽序列的結構域內進行的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白質穩定與生物活性保護具體為可防止高溫、干燥、冷凍和反復凍融對蛋白質損傷、變性和生物活性喪失。

在(b)所述多肽中，ZYZ20多肽之間的連接氨基酸較佳為核酸內切酶的酶切位點所編碼。

為了使發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽便于純化，本發明可在(a)或(b)或(c)所述多肽的氨基末端或羧基末端連接有Poly-His標簽或GST標簽。

發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽，較好的為序列表中SEQID?NO.2所述的氨基酸序列，它是由2個ZYZ20多肽首尾串聯而成的多肽；更好的為序列表中SEQ?ID?NO.3所述的氨基酸序列，它是由4個ZYZ20多肽首尾串聯而成的多肽。

本發明的蛋白質穩定與生物活性保護多肽可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。其中(c)所述多肽的編碼基因可通過將(a)或(b)所述多肽的編碼基因中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端連上Poly-His標簽或GST標簽的編碼序列得到。