[發明專利]人工改造合成的殺蟲基因及其編碼的蛋白質與應用

有效

• 申請號: 200810065477.2
• 申請日: 2008-03-03
• 公開（公告）號: CN101255432A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發明（設計）人: 崔洪志;陳文華;楊年松;王君丹;江輝松
• 申請（專利權）人: 創世紀轉基因技術有限公司
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/82;C12N5/10;C07K14/325;A01H1/00;A01H5/00
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所
• 代理人: 孫鑫

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，尤其涉及一種人工改造合成的殺蟲基因以及其構建的植物表達載體及其在抗蟲轉基因植物研制方面的應用。

背景技術

植物生長過程中易遭受蟲害，每年因蟲害造成的農作物損失量十分巨大。為防治植物蟲害發生，需大量噴施農藥，長期大量使用化學農藥，可導致害蟲抗藥性增強，并且會大量殺傷其天敵，生態失衡，步入惡性循環。利用基因工程手段使植物獲得抗蟲性，目前已被廣泛采用，用于植物抗蟲基因工程的基因主要包括：(1)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)殺蟲晶體蛋白(insecticidal?crystal?proteins，ICPs)基因：如Cry1Ac，Cry1F，Cry2Ab等；(2)蛋白酶抑制劑(proteinase?inhibitors，PIS)基因：如豇豆(Vigna?sinensis)胰蛋白酶抑制劑(cowpea?trysin?inhibitor，CpTI)基因CpTI等；(3)淀粉酶抑制劑(amylase?inhibitor，AI)基因：如菜豆(Phaseolusvulgaris)α-淀粉酶抑制劑基因α-αi等；(4)植物外源凝集素(lectin)類基因：如雪花蓮外源凝集素(Galanthus?nivalis?aggulutinin，GNA)基因gna等；(5)昆蟲特異性神經毒素(neurotoxin)基因：如蝎毒素基因Bank?I?T₄等。在生產上利用最成功的基因主要有：Bt殺蟲晶體蛋白基因和CpTI基因。其中應用最廣泛的是Bt殺蟲晶體蛋白基因，即蘇云金芽孢桿菌(Bt)內毒素晶體蛋白基因，克隆于蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌(Bt)是1901年發現的一種革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，已知其是可產生對多種昆蟲，如鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和雙翅目(Dipterans)等作物害蟲有毒性的多種伴孢結晶蛋白質。這種殺蟲蛋白質已經發現了五十多大類，三百多種。Bt殺蟲蛋白在昆蟲消化道內消化酶的作用下，蛋白被水解，釋放出約60～70kDa抗蛋白酶的活性毒素分子?；钚远舅胤肿涌膳c腸道上皮細胞紋緣膜上的特異性受體結合，并發生作用而使細胞膜穿孔。消化道上皮細胞的離子、滲透壓平衡遭到破壞，最終導致昆蟲死亡。由于其殺蟲的專一性和高度選擇性，所以對植物和包括人在內的動物沒有毒害，而且是環境可以接受的。自80年代后期以來，許多實驗室已將Bt殺蟲基因導入到不同植物組織的細胞中，并已在被轉化的細胞和植物中表達了這種來源與微生物的殺蟲基因，使轉基因植物具有抗蟲性。

不同種類Bt殺蟲蛋白殺蟲譜可能不同，目前人們已經發現了對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目據有毒性的殺晶體蛋白的大小及性狀也不同。在1995年無脊椎病理學會(Society?for?Invertebrate?Pathology，SIP)年會上專門成立了由Crickmore等人組成的Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會，提出了以殺蟲蛋白氨基酸序列同源性為唯一標準的分類命名體系，將殺蟲基因分為17類，36亞類(Crickmore?et?al.1995)，2008年增補為54類，101亞類(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中Cry2Aα對棉鈴蟲、紅鈴蟲、玉米螟、煙芽夜蛾、粉紋夜蛾、黎豆夜蛾、稻縱卷葉螟、大豆夜蛾、熱帶家蚊等害蟲均具有殺蟲效果。

由于遺傳密碼有64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分，如果直接將昆蟲的基因直接轉化至植物中，在一定程度上會影響其蛋白的表達，利用偏愛密碼子(preferred?codons)并避免利用率低的或稀有的密碼子合成基因，可以增加蛋白表達量。

另外Bt殺蟲晶體蛋白的N端小段氨基酸殘基在毒蛋白活化過程中被切除是殺蟲活性所必須的。

發明內容

為提高轉基因植物的抗蟲性，本發明的目的在于提供一種在植物中能高效表達的殺蟲基因。

一種人工改造合成的殺蟲基因，具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

一種人工改造合成的殺蟲基因，具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，SEQ?IDNO：2所示的核苷酸序列與SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列相比，5’端在起始密碼子后少84個堿基。

所述核苷酸序列采用了植物偏愛性密碼子。

所述核苷酸序列采用了棉花偏愛性密碼子。

本發明的第二個目的在于提供一種含有上述人工改造合成的殺蟲基因并可在植物中表達該殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質。