[發明專利]一種提取植物DNA的方法

無效

• 申請號: 200810064903.0
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101302509A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 王玉成;劉桂豐;李慧玉;姜靜;楊傳平
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H1/06
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明涉及一種提取DNA的方法。

背景技術

DNA是分子生物學研究的主要對象之一，在進行分子生物學操作過程中，基因組DNA的質量好壞是影響其成敗的關鍵因素。例如，在PCR過程中多糖、多酚和色素等都會嚴重的影響DNA聚合酶的活性，干擾引物與模板的結合導致擴增失敗。

植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物質，多糖是提取植物DNA的主要干擾物質，由于它與核酸的物理性質非常相似，在提取過程中多糖物質通常與DNA共沉淀下來，非常難與DNA分開，因此嚴重地影響了所提取的DNA的質量。目前，國內外在提取植物基因組DNA過程中，為了去除多糖采用以下幾種方法：①用低濃度乙醇去除多糖法：在DNA提取液中加入無水乙醇至終濃度10％～30％，再通過酚/仿抽提去除多糖，或者是先用濃度為100mmol/L的NaAc溶解DNA沉淀，再用低濃度乙醇抽提分離出多糖；②CTAB法：CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)比SDS(十二烷基硫酸鈉)去除多糖類物質的效果好，適當地提高CTAB和β-巰基乙醇的含量(不低于1％)可有效地去除多糖等次生物質；但是此方法中如果CTAB濃度過高，在保溫時提取材料與CTAB緩沖液難以充分混勻，這就需要延長保溫時間，也同時增加了DNA降解的機率；③在去除多糖時采用先加不含CTAB的緩沖液抽提多糖，在通過離心除去多糖的方法；④高鹽沉淀多糖法：認為緩沖液中含有高濃度的NaCl將有助于去除多糖。

但是目前的這幾種去除多糖提取植物DNA的方法都只對含有少量多糖的植物提取材料有效，而對于多糖含量高的植物(如：白樺)或部位(如：老葉片)基本無效，因此目前尚未有一種普遍有效的去除植物材料中多糖，保證所提取DNA質量的DNA提取方法，特別是缺乏有效的、針對多糖含量高的植物的DNA提取方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前植物DNA提取方法都只對含有少量多糖的植物提取材料有效，對多糖含量高的植物或部位基本無效的問題，而提供的一種提取植物DNA的方法。

提取植物DNA按以下步驟進行：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末轉入1mL提取緩沖液I中在溫度為45±1℃的條件下水浴10min，再在10000g條件下離心10min；二、取步驟一離心沉淀物轉入0.5～1mL提取緩沖液II中在溫度為65±1℃的條件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的條件下離心5min；三、取步驟二離心上清液并加入上清液等體積的異丙醇，混勻后在10000～12000g條件下離心10min，再用體積濃度為75％、體積為0.5mL的乙醇洗滌離心沉淀2次，然后室溫氣干，即得到植物提取材料的DNA；其中步驟一中的提取緩沖液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl和去離子水組成，提取緩沖液I中乙二胺四乙酸的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為0.16mol/L；步驟二中的提取緩沖液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基肌氨酸鈉(SLS)、巰基乙醇和去離子水組成，提取緩沖液II中乙二胺四乙酸的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為1mol/L、十六烷基三甲基溴化銨的濃度為2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1g/100mL、巰基乙醇的濃度為1mL/100mL。

本發明方法步驟一中在45±1℃的條件下進行水浴可以使多糖和RNA完全溶解在提取緩沖液I中，而DNA則與蛋白形成復合物DNP沉淀出來(DNP在提取緩沖液I中溶解度極低)，因此通過離心即可將DNA與多糖及RNA分開。本發明方法步驟二提取緩沖液II中CTAB的濃度提高到2.5g/100mL，同時還加入了另一種去污劑十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，促進DNA與蛋白質的分離，并提高了DNA在提取緩沖液II中的溶解。本發明方法是一種可以廣泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影響，在DNA提取過程中可將植物中的多糖徹底去除，提高了DNA提取的效率、純度和質量。

附圖說明

圖1是具體實施方式六所提取的DNA的凝膠電泳圖，圖2是采用現有CTAB法所提取的DNA的凝膠電泳圖。

具體實施方式