[發明專利]一種表達木糖醇脫氫酶基因的質粒的構建方法

無效

• 申請號: 200810064830.5
• 申請日: 2008-06-30
• 公開（公告）號: CN101302534A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 平文祥;葛菁萍;杜春梅;凌宏志;宋剛;趙丹;高冬妮;洛雪
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/53
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明涉及一種質粒載體的構建方法。

背景技術

現有的釀酒酵母生產乙醇均是以己糖為原料，由于釀酒酵母缺乏代謝木糖的兩種關鍵酶——木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)，所以不能使木糖代謝后產生乙醇。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前釀酒酵母缺乏木糖醇脫氫酶(XDH)，而不能使木糖代謝后產生乙醇問題，而提供的一種表達木糖醇脫氫酶基因的質粒的構建方法。

本發明表達木糖醇脫氫酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行：一、以休哈塔假絲酵母基因組為模板克隆xyl2基因；二、回收、純化xyl2基因片段后與pGMT?vector載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-xyl2；三、重組質粒p406ADH1-1的構建，克隆質粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架引入ADHt基因；四、重組質粒p406ADH1-2的構建，克隆質粒pKT0150中的KanR基因，再將KanR基因加入質粒p406ADH1-1；五、重組質粒p406ADH1-3的構建，克隆釀酒酵母中的rDNA基因，再將rDNA基因加入質粒p406ADH1-2；六、將xyl2基因加入質粒p406ADH1-3，即得到表達木糖醇脫氫酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5’-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3’，下游引物序列為5’-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3’；步驟三中ADHt基因序列擴增上游引物序列為5’-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列為5’-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步驟四中KanR基因擴增上游引物序列為5’-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3’，下游引物序列為5’-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3’；步驟五中rDNA基因擴增上游引物序列為5’-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3’，下游引物序列為5’-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。

本發明構建了表達木糖醇脫氫酶基因的質粒，用本發明構建的表達木糖醇脫氫酶基因的質粒轉化釀酒酵母工業菌株得到的重組菌HDTG-xyl2能夠產生休哈塔假絲酵母中xyl2基因編碼的木糖醇脫氫酶(XDH)，其木糖醇脫氫酶活力較出發菌株大大提高，出發菌株不產生木糖醇脫氫酶，重組菌株的木糖醇脫氫酶的酶活為1.51U/mg，酶活力提高，表明構建的表達木糖醇脫氫酶基因的質粒轉化釀酒酵母后實現了木糖醇脫氫酶基因的高效穩定表達。對本發明構建了表達木糖醇脫氫酶基因的質粒轉化釀酒酵母進行穩定性測定，結果現實60世代后的穩定性為99％，在非選擇性壓力下，整合于釀酒酵母染色體上的外源基因片斷具有良好的遺傳穩定性，能適合用于工業生產的粗放環境。

具體實施方式