[發(fā)明專利]一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810064829.2
• 申請(qǐng)日: 2008-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN101302533A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 平文祥;葛菁萍;凌宏志;杜春梅;宋剛;趙丹;高冬妮;于新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/53
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 單軍

1.一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行：一、克隆休哈塔假絲酵母菌的XYL1基因；二、克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列；三、克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、純化步驟一至三制備的基因片段，然后再分別與pGEMT?Easy載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR；五、構(gòu)建質(zhì)粒pADH，以釀酒酵母整合質(zhì)粒p406ADH1為骨架引入ADHt基因；六、構(gòu)建質(zhì)粒pAK，將KanR基因引入質(zhì)粒pADH中；七、將XYL1基因引入質(zhì)粒pAK，即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒；其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’，下游引物序列為5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’；步驟二中擴(kuò)增上游引物序列為5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列為5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步驟三中擴(kuò)增上游引物序列為5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列為5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步驟五中用限制性內(nèi)切酶Xho?I和Kpn?I對(duì)質(zhì)粒p406ADH1和pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶切，然后用T4?DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pADH；步驟六中用限制性內(nèi)切酶Aat?II對(duì)質(zhì)粒pGMT-KanR和pADH分別進(jìn)行單酶切，然后用T4?DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pAK；步驟七中用限制性內(nèi)切酶Xba?I和BamH?I對(duì)質(zhì)粒pAK和pGMT-XYL1分別進(jìn)行雙酶切，然后用T4?DNA連接酶進(jìn)行連接，即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為10μL，由1μL?10×PCR?buffer、0.8μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μL濃度為1pmol/μL的上游引物、1μL濃度為1pmol/μL的下游引物、0.8μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL休哈塔假絲酵母菌基因組DNA、0.2μL濃度為5U/mL的Taq酶和余量的重蒸餾水的組成；PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃1min，退火50℃1min，延伸72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，延伸72℃10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為10μL，由1μL?10×PCR?buffer、0.8μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μL濃度為1pmol/μL的上游引物、1μL濃度為1pmol/μL的下游引物、0.8μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL質(zhì)粒pKT0150、0.2μL濃度為5U/mL的Taq酶和余量的重蒸餾水的組成；PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2min，變性94℃45s，退火49℃30s，延伸72℃45s，共30個(gè)循環(huán)，延伸72℃7min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中PCR反應(yīng)體系為10μL，由1μL?10×PCR?buffer、0.8μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μL濃度為1pmol/μL的上游引物、1μL濃度為1pmol/μL的下游引物、0.8μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL質(zhì)粒pKT0150、0.2μL濃度為5U/mL的Taq酶和余量的重蒸餾水的組成；PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2min，變性94℃1min，退火45℃1min，延伸72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，延伸72℃7min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中的連接產(chǎn)物pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α進(jìn)行保存擴(kuò)增。