[發(fā)明專利]一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810064397.5
• 申請(qǐng)日: 2008-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN101260423A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜毓君;閆冰;韓希妍;曲妍妍;王明娜;相麗;呂琦;畢宇涵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 榮玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測李斯特菌的方法。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生(增多性)李斯特菌(Listeria?monocytogenes，Lm)，簡稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，其pH值生長范圍為4.39～9.40，在4℃下也可生長，因此增加了對(duì)冷藏食物的危害性。單增李斯特菌廣泛存在于土壤、動(dòng)物和水產(chǎn)品中，主要通過乳及乳制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物傳播。因其具有獨(dú)特的生理特性，能引起人類腦膜炎、敗血癥等疾患，尤以妊娠期婦女、新生兒以及免疫功能低下的病人更易感染，致死率達(dá)30％以上。

現(xiàn)有檢測單增李斯特菌的方法全過程至少需要4～7天，檢出限度不夠靈敏，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而PCR和探針雜交都無法排除死菌和活菌，由于死菌中的DNA降解較慢，也容易產(chǎn)生假陽性。檢測技術(shù)的假陽性會(huì)帶來錯(cuò)誤的信息和判斷，根據(jù)假陽性結(jié)果所采取的措施可能會(huì)帶來不必要的損失。熒光染料(EMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合可以對(duì)活菌進(jìn)行檢測，其原理是EMA可通過被破壞的細(xì)胞膜與DNA相結(jié)合，而結(jié)合了EMA的基因組DNA在PCR反應(yīng)中不能進(jìn)行擴(kuò)增；反之，EMA不能通過活菌的細(xì)胞膜，所以不能與基因組DNA相結(jié)合，PCR反應(yīng)可正常進(jìn)行。但有研究報(bào)告指出EMA可穿透部分細(xì)菌活體的細(xì)胞膜，并與DNA雙鏈結(jié)合，造成活菌基因組DNA損失，所以PCR檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有檢測單增李斯特活菌的方法容易產(chǎn)生假陽性的問題，而提供一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法。

本發(fā)明的檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法按如下步驟進(jìn)行：

一、取待測物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)8小時(shí)，再取培養(yǎng)液4mL放于5mL環(huán)氧樹脂管中，在室溫下以14000r/min的速度離心3min，得到菌泥；

二、將得到的菌泥重懸于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重懸于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直徑為0.2mm的玻璃珠，2000轉(zhuǎn)/分渦旋5min。然后以14000r/min的相對(duì)離心力離心3min；

三、取離心后懸浮物700μL與同體積pH值為5.5的水飽和酚混合于1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，在68℃的條件下保溫5min，然后在室溫下以14000r/min的速度離心4min；

四、取600μL的上層水相與同體積氯仿混合于另一個(gè)1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，以2000r/min的速度渦旋20s后，再以14000r/min的速度離心4min；

五、再取400μL上層水相與800μL的絕對(duì)乙醇和40μL、濃度為3mol/L的醋酸鈉混合，以2000r/min的速度渦旋20s后，于-20℃保溫10min，再以16000r/min的速度離心5min獲得RNA沉淀物；

六、用體積為1mL、質(zhì)量濃度為70％的乙醇洗滌沉淀物，以16000r/min的速度離心3min后，在室溫下干燥至無乙醇?xì)埩簟?/p>

七、將干燥的RNA重懸于20μL?DEPC水中，加入DNA酶(DNase?I)和RNA酶抑制劑(Ribonuclease?Inhibitor)在37℃下保溫15min，再放入60℃的水浴10min；

八、RNA抽提之后進(jìn)行RT-PCR操作，反轉(zhuǎn)錄條件為：在95℃保溫2min后，在42℃保溫15min?PCR反應(yīng)參數(shù)為：在95℃的條件下預(yù)變性10s，40個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)均在95℃的條件下變性5s，在60℃的條件下延伸34s，其中反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR的正向引物為5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，反向引物為5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，熒光探針為FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通過熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)，各循環(huán)數(shù)的相對(duì)熒光值數(shù)據(jù)通過軟件分析形成圖譜，通過圖譜判斷待檢測物品是否含有單增李斯特活菌。

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)試劑用量

步驟七中的DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。

步驟二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇∶乙醚∶氨水的體積比為1∶1∶1，其中甲醇的濃度為10.4mol/L，乙醚的濃度為4.5mol/L，氨水的濃度為9.5mol/L。