[發明專利]人巨細胞病毒UL54基因的siRNA序列及應用

無效

• 申請號: 200810063309.X
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101333526A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 尚世強;陶然;趙正言;胡妙鳳;段群軍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K31/713;A61P31/20
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于生物技術，涉及分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及針對人巨細胞病毒(HCMV)UL54基因的siRNA序列的設計、篩選及其在體內外抑制人巨細胞病毒的應用。

背景技術

人巨細胞病毒(human?cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中極為普遍，成年人血清抗體陽性率可達80％以上。HCMV在初次感染后可長期潛伏在體內，甚至終身帶毒，在免疫功能不成熟或缺陷的人群(如AIDS、器官移植患者等)中，潛伏的HCMV可被激活而引起嚴重疾病。同時，HCMV也是人類先天性感染最常見的病原之一，可造成流產、死胎、先天畸形、聽力障礙、發育遲緩等后果。目前，治療HCMV感染的藥物主要包括更昔洛韋(ganciclovir，GCV)、膦甲酸鈉(fascarnet，FOS)和西多福韋(cidofovir，CDV)，3種藥物均通過抑制HCMV的增殖必需基因——UL54(DNA多聚酶)從而抑制病毒DNA合成。但是，隨著藥物毒副作用和HCMV耐藥現象日趨嚴重，傳統的HCMV治療方法正面臨重大挑戰。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是由內源或外源雙鏈RNA引起的同源mRNA特異性降解的現象，是細胞內防御病毒感染、修復遺傳損傷的一種重要保護機制，被稱為RNA基礎上的細胞“免疫”系統。由于RNAi具有高效、穩定、毒性低、特異性高等特點，自報道以來已被迅速應用于抗病毒研究中，在抑制病毒復制、表達等方面展現出廣闊的應用前景。

哺乳動物細胞中，21-23個核苷酸長度的雙鏈RNA在RNAi過程中起著關鍵作用，被稱為小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)。siRNA通過識別特定的mRNA靶序列起作用，這些靶序列可能存在復雜的二級結構，或者掩藏在RNA序列高度折疊的區域內，甚至與蛋白質形成緊密的復合物，從而干擾siRNA的識別。因此，針對某一特定基因，不同靶點的抑制效果差別很大，合理設計siRNA并篩選出理想靶點是有效發揮RNAi機制的重要條件。

目前，制備siRNA的方法主要包括化學合成法、體外轉錄法、長片段dsRNA經RNase?III降解法、siRNA表達載體轉錄法及PCR制備的siRNA表達框法等5種。其中，siRNA表達載體轉錄法是將轉錄siRNA的特定DNA序列定向克隆入含有U6或H1啟動子的表達載體中，載體轉染細胞后經過轉錄可持久、穩定地表達siRNA。與其他制備siRNA的方法相比，載體法制備siRNA具備可在細胞中持續抑制靶基因表達、可大量擴增便于長期研究、相對經濟實用等優點，克服了其他方法費用高、易降解、體內表達短暫等缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種人巨細胞病毒(HCMV)UL54基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-CTCGATGAAGTCAAGAAGT-3’。

本發明的另一個目的是提供該cDNA序列在制備治療人巨細胞病毒感染藥物重的應用。

本發明根據siRNA設計原則，構建針對HCMV?UL54(DNA多聚酶)基因的siRNA真核表達載體，轉化大腸桿菌后提取質粒，分別轉染AD293細胞和MRC-5細胞，最終篩選到1個能有效抑制UL54基因表達的siRNA序列，可用于治療HCMV感染藥物的制備。

本發明提供的siRNA序列針對HCMV的增殖必需基因UL54，目前國內外尚無用siRNA表達載體法篩選HCMV?UL54基因有效siRNA序列的報道。以此序列為基礎的真核表達載體具有在細胞中持續、有效抑制UL54基因mRNA和蛋白表達的優點，故可作為HCMV治療藥物開發的一個新靶點。

附圖說明

圖1是siRNA真核表達質粒與報告質粒共轉染AD293細胞48h后熒光顯微鏡觀察結果。

圖2是Western?blot檢測MRC-5細胞中siRNA表達質粒對UL54蛋白表達的抑制。

具體實施方式

本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。

實施例一??siRNA真核表達載體體外抑制UL54-EGFP融合蛋白的表達