[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征二價(jià)重組腺病毒疫苗及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810063123.4
• 申請(qǐng)日: 2008-07-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101380468A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉光清;云濤;倪征;余斌;陳柳;華炯鋼;李雙茂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;C12N15/62;C12N15/861;C12N7/01;C12N7/02;A61P31/12;A61P15/00;A61P11/00
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

1、豬繁殖與呼吸綜合征二價(jià)重組腺病毒疫苗，其特征在于：該疫苗可通過(guò)在PRRSV?GP5和M蛋白之間插入一具有自我裂解的FMDV2A基因相連接，構(gòu)建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組，將重組病毒DNA經(jīng)酶切，轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后，得重組腺病毒rAd-GP5-2A-M，經(jīng)腺病毒純化、擴(kuò)增等工藝、步驟，制備成二價(jià)重組腺病毒疫苗而獲得。

2、制備權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征二價(jià)重組腺病毒疫苗的方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：

(1)GP5-2A-M融合基因的構(gòu)建：根據(jù)PRRSV美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株ATCC?VR-2332和FMDV?China/99?O型毒株的基因序列，各設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)PRRSV國(guó)內(nèi)分離株NB/04毒株GP5、M和2A基因的特異性融合引物，引物序列如下：

AdGP5：5’-CGC?GGTACC?CCA?CCA?TGG?TGG?GGA?AAT?GCT?TG-3’

AdGP5-2A:5’-AAC?GTC?TCC?TGC?TAA?CTT?CAA?AAG?ATC?AAA?GTT?CGT?GAGACG?ACC?CCA-3’

AdM-2A:5’-TTA?GCA?GGA?GAC?GTT?GAG?TCC?AAC?CCC?GGA?CCC?ATG?GGG?TCGTCT?CTA-3’

AdM:5’-TATGCGGCC?GCT?TAT?TTG?GCA?TAT?TTA?AC-3’

以Marc-145細(xì)胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT；然后以cDNA產(chǎn)物為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出NB/04毒株含F(xiàn)MDV2A基因的GP5和M全基因，再通過(guò)融合PCR技術(shù)，以AdGP5和AdM引物將GP5、2A和M蛋白基因融合為GP5-2A-M融合基因；

(2)穿梭載體pShuttle-CMV-GP5-2A-M的構(gòu)建：在步驟(1)融合基因GP5-2A-M的GP5的上游和M的下游引物的5′端引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶KpnI和NotI酶切位點(diǎn)，通過(guò)這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV中，通過(guò)酶切和PCR鑒定，獲得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭載體pShuttle-CMV-GP5-2A-M；

(3)穿梭載體pShuttle-CMV-GP5-2A-M與腺病毒骨架載體pAdEasy-1的同源重組與純化：將步驟(2)鑒定含有GP5-2A-M融合基因的穿梭載體pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，電轉(zhuǎn)化至已轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)行菌內(nèi)同源重組；用卡那霉素篩選獲得重組病毒DNA，PacI酶切鑒定，將其中正確的重組病毒DNA再轉(zhuǎn)化XL10—Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，以純化重組腺病毒DNA；

(4)重組腺病毒rAd-GP5-2A-M的獲得與鑒定：鑒定好的重組腺病毒DNA經(jīng)過(guò)DpaI酶切線性化后，轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞內(nèi)，重組腺病毒DNA在胞內(nèi)包裝成完整的重組腺病毒rAd-GP5-2A-M；通過(guò)噬斑純化后，采用RT-PCR、IFA和Western?blot方法檢測(cè)GP5-2A-M聚合蛋白的基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及蛋白裂解；

(5)重組腺病毒的擴(kuò)繁與檢測(cè)：將步驟(4)鑒定、純化后的重組腺病毒rAd-GP5-2A-M在HEK-293A細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代30次，其中，每5代檢查一次重組腺病毒對(duì)GP5-2A-M融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)與裂解質(zhì)量，同時(shí)測(cè)定其TCID₅₀，從中篩選出表達(dá)穩(wěn)定，接毒后細(xì)胞病變(CPE)穩(wěn)定，種毒毒價(jià)穩(wěn)定在10^10.43TCID₅₀/1.0ml的重組腺病毒，-80℃保存；

(6)二價(jià)重組腺病毒疫苗的制備：取步驟(5)重組腺病毒，按10¹⁰?TCID₅₀接種于HEK-293A細(xì)胞上，進(jìn)行擴(kuò)大病毒培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70-90％時(shí)，取用長(zhǎng)成的單層HEK293-A細(xì)胞收毒，經(jīng)凍融3次即可獲得PRRSV重組腺病毒rAd-GP5-2A-M疫苗，經(jīng)質(zhì)檢、分裝、包裝后即成。