[發明專利]立枯絲核菌菌絲體在提高哈茨木霉菌產木霉素水平中的用途

無效

• 申請號: 200810062336.5
• 申請日: 2008-05-19
• 公開（公告）號: CN101275152A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 俞曉平;申屠旭萍;董勝張;王為民
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及提高哈茨木霉菌產素水平的方法。

背景技術

微生物發酵中效價往往是決定生產成本以及實現工業化生產的瓶頸所在。對菌株進行遺傳改造、培養基及培養條件的優化等是提高產素水平的常用方法。近年來，真菌誘導子在植物細胞培養和微生物發酵生產次生產物的研究中得到廣泛應用。研究組從枸骨中分離篩選到一株產木霉素(Trichodermin)的活性內生真菌——哈茨木霉菌(Trichoderma?harzianum)。木霉素對多種農作物病原真菌具有很強的抑制作用，在防治作物病害中具有廣泛的應用前景。從自然界分離的野生型菌株往往產素水平較低，生產能力低下。

發明內容

在研究提高哈茨木霉菌產素水平的試驗中，生物活性測定表明病原真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia?solani)活菌絲的加入能夠提高哈茨木霉菌發酵液的抑菌效果。進一步研究發現，滅活的立枯絲核菌菌絲體的加入同樣能夠提高哈茨木霉菌發酵液的抑菌效果。采用氣相色譜分析發酵液中木霉素的含量，顯示添加滅活的立枯絲核菌菌絲體后發酵液中木霉素的濃度與對照相比提高了數倍。

本發明通過在哈茨木霉菌培養液中添加滅活的立枯絲核菌菌絲體，提高發酵液中木霉素的濃度。該發明為哈茨木霉菌的產素水平提高提供了一種可靠的方法。

本發明的目的是針對野生型菌株哈茨木霉產素水平低的不足，提供一種提高其產素水平的方法；本發明的另一目的是提供利用該菌株代謝產物木霉素制備微生物農藥的方法。

本發明目的通過以下技術方案來實現：

一種提高哈茨木霉菌產素水平的方法按以下步驟進行：

(1)立枯絲核菌的培養

立枯絲核菌可以通過常規的組織分離法從發病的植物中分離得到。

培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)，300mL三角瓶裝PD液體培養基60mL，用接種鉤挑取少許立枯絲核菌菌絲于滅菌的培養瓶中，置26℃～28℃搖床，200r/min，振蕩培養6天，發酵液經5000r/min離心10min，收集菌絲體，在-53℃、0.5mbar條件下真空冷凍干燥15h，滅活的菌絲體研磨成小顆粒，備用；

(2)哈茨木霉菌液體發酵

哈茨木霉菌為從枸骨中分離的內生真菌。發酵培養基配方：其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為立枯絲核菌菌絲體小顆粒60mg，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、葡萄糖24g、MnCl₂0.01g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄0.05g；對照中不添加立枯絲核菌菌絲體，其余組分與含量同發酵培養基配方；300mL三角瓶裝發酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌孢子懸液(1×10⁶個/mL)于滅菌的培養瓶中，置28℃搖床，180r/min，振蕩培養108h，發酵液經5000r/min離心10min，上清液用于木霉素含量的測定；

(3)木霉素的檢測

方法：采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱(以5％苯基甲基硅氧烷為固定液，30m×320μm×0.25μm)；檢測器：氫火焰離子檢測器(FID)；檢測器溫度270℃；進樣口溫度250℃；柱溫度：程序升溫，初始溫度100℃，保持5min，以10℃·min^-1升溫至260℃保持5min；載氣：氮氣；流速1.5mL·min^-1。

本發明的有益效果：

一是本發明通過在哈茨木霉菌培養液中添加立枯絲核菌菌絲體，提高發酵液中木霉素的濃度，這為哈茨木霉菌的產素水平提高提供了一種可靠的方法；

二是本發明提供了制備防治作物真菌病害的微生物源農藥的活性成分木霉素，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提高木霉素產素水平的方法作進一步描述。

實施例1：

立枯絲核菌的培養：培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)，300mL三角瓶裝PD液體培養基60mL，用接種鉤挑取少許立枯絲核菌菌絲于滅菌的培養瓶中，置26℃～28℃搖床，200r/min，振蕩培養6天，發酵液經5000r/min離心10min，收集菌絲體，在-53℃、0.5mbar條件下真空冷凍干燥15h，滅活的菌絲體研磨成小顆粒，備用；