[發(fā)明專利]重組金黃色葡萄球菌腸毒素I口服制劑及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810062278.6
• 申請日: 2008-06-12
• 公開（公告）號: CN101293092A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳樞青;丁丁
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K39/085
• 分類號: A61K39/085;C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;A61P35/00;A61P37/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發(fā)明屬生物工程，涉及重組金黃色葡萄球菌腸毒素I(StaphylococcalEnterotoxin?I，SEI)的制備以及以SEI主要有效成分的口服制劑的制備和在腫瘤治療中的應用。具體地說，就是利用基因工程方法制備高純度重組金黃色葡萄球菌腸毒素I蛋白及其相關蛋白制品，并將其制備成口服制劑，用于腫瘤患者的治療和康復。

背景技術

金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal?Enterotoxin)由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生。目前已經(jīng)獲得鑒定的腸毒素有二十余種，其中包括經(jīng)典的腸毒素如SEA、SEB、SEC、SED、SEE等，以及新近發(fā)現(xiàn)的腸毒素SEG～SEQ。不同種類腸毒素分子量為25～33kD不等，各類腸毒素氨基酸序列具有一定的同源性(28％～98％)，通過蛋白質(zhì)晶體衍射以及計算機三維結構模擬技術可知，各類腸毒素的三維結構十分相似，均具有兩個結構域，多數(shù)腸毒素包含一個對維持三維結構十分重要的二硫鍵。

金葡菌腸毒素是一類典型的細菌性超抗原，能在短時間內(nèi)引起宿主體內(nèi)T細胞的大量增殖與活化。研究發(fā)現(xiàn)，腸毒素分子可以以完整分子結合于抗原提呈細胞(Antigen?presenting?cells，APC)表面的MHC-II類分子的抗原肽結合溝槽外側(cè)，進而通過與T細胞受體(T?cell?receptor，TCR)Vβ區(qū)特異性結合激活T細胞。與普通抗原不同的是，腸毒素不需要同時被TCR分子的Vα、Jα、Jβ、Vβ和Dβ等各部分共同識別，也無MHC-II限制性，使得金葡菌腸毒素只需極低濃度(0.01～10ng/mL)即可激活2～30％的初始T淋巴細胞，是普通抗原激活的T細胞數(shù)量的10³～10⁶倍。同時，腸毒素亦能促進受其激活的T細胞分泌多種細胞因子，間接激活B細胞、NK細胞，因此金葡菌腸毒素能高效地刺激和增強免疫應答。

介于此性質(zhì)，國內(nèi)外對腸毒素超抗原應用于腫瘤治療的研究已有大量的文獻報導。Frank等人將SEB(10μg/mL)膀胱內(nèi)灌注荷RT112和RT4細胞小鼠，六周后約76％的小鼠膀胱內(nèi)腫瘤消失，其余小鼠膀胱內(nèi)的腫瘤細胞則產(chǎn)生明顯調(diào)亡現(xiàn)象。Hedlund等人進行的體內(nèi)實驗表明，SEA激活T細胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內(nèi)呈劑量依賴關系，注射后1天出現(xiàn)最大效應，增殖效應維持4天。Litton等人用結腸癌相關抗原C242的單抗Fab片段和SEA制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)能夠高效地促進T細胞和單核細胞在腫瘤組織處聚集、滲透，并誘導T細胞產(chǎn)生大量細胞因子，同時誘導結腸癌細胞產(chǎn)生IL-4、IL-10、TNF-α等細胞因子，并引起癌細胞IFN-γ受體、Fas受體表達上調(diào)，從而有效誘導腫瘤細胞調(diào)亡。Kodama等制備了SEA的突變體mSEAD227A，該突變蛋白與天然SEA相比降低了與MHC-II分子的結合能力，但未改變對T細胞的刺激增殖能力。實驗證明家兔對該突變體的耐受力是天然SEA的500倍。利用該突變蛋白與抗MUC1抗原的單克隆抗體MUSE11制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)和體外均能高效地增強T-LAK細胞對表達MUC1的膽管癌細胞的特異性細胞毒作用。

在國外，以金葡菌腸毒素及其融合蛋白為主要有效成分的藥物已經(jīng)進入了臨床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565(重組SEA與C242單克隆抗體的Fab片段制備的融合蛋白)的I期臨床實驗表明，患者可能產(chǎn)生的細胞毒性與給藥劑量密切相關，而給藥劑量又取決于患者的體重和血液循環(huán)中抗SEA抗體濃度。在給藥過程中，76％的患者出現(xiàn)不同程度的體溫升高，62％的患者出現(xiàn)不同程度的血壓降低，其主要因素是誘導產(chǎn)生的IL-2和TNF，毒副作用均為暫時性的，容易得到控制。他們發(fā)現(xiàn)，治療開始之前病人體內(nèi)抗SEA抗體在一定程度上降低了毒副反應，通過綜合考慮個體體重與抗SEA抗體濃度，可以確定一個副作用最小的給藥劑量。Jonathan等人完成了PNU-214565的第二代產(chǎn)品PNU-214936的I期臨床實驗，目的為了在非小細胞肺癌(non-small-cell?lung?cancer，NSCLC)患者身上實現(xiàn)個體化給藥，并使用Bayesian模型結合過量劑量控制方法進行劑量放大，確定了該藥的最大耐藥劑量(MTD)。