[發明專利]固、液二步發酵工藝生產飼用嗜酸乳桿菌的方法

有效

• 申請號: 200810060504.7
• 申請日: 2008-04-01
• 公開（公告）號: CN101250493A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 李孝輝;葉琪明;陳兵;許堯興;李艷麗;許少春
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/16;A23K1/16;C12R1/23;C12R1/73
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其涉及以解脂假絲酵母的固體發酵和嗜酸乳桿菌的液體發酵二步工藝，生產飼用嗜酸乳桿菌的方法。

背景技術

飼用微生物活菌制劑，能維持、調整動物腸道內微生態平衡，直接或間接對病原菌起干擾、排除、拮抗作用，從而提高抗病能力，提高動物生產水平。由于具有無抗藥性、無殘留，且具有提高動物生產性能和預防疾病的作用，可克服長期大量使用抗生素造成的一些不良后果，被認為是抗生素潛在的、天然的、對環境和健康無害的替代物。嗜酸乳桿菌具有較強的耐酸、耐鹽和耐膽汁鹽能力，不用任何處理就能順利通過胃腸環境而有效定殖于動物腸道內形成優勢種群，而且其產的乳酸和乳酸菌素可直接作用于病源細菌。這是其它飼用微生物活菌劑無法比擬的。嗜酸乳桿菌這種獨特的生理、生化特性被認為是最理想的促生長替代抗生素的活菌劑，具有廣闊的發展應用前景。

由于嗜酸乳桿菌的營養條件要求苛刻，目前主要是以牛奶為基本培養基，再添加牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖等物質，或以MRS培養基為基本培養基，再添加一些生長刺激物，但因這些用來做培養基的物質，市場售價較麩皮、豆粕、玉米粉等普通農副產品貴出許多倍，用這些物質來生產嗜酸乳桿菌，其成本對醫藥行業來說尚能接受，但對養殖行業作為飼料添加劑來說難以承受。而其它有些方法生產成本雖然不高，如采用紅糖或葡萄糖再加上蛋白胨和無機鹽等，但發酵水平極低，菌數只有或小于10⁸級別，達不到好的應用效果。這些問題均阻礙了嗜酸乳桿菌的生產與在養殖行業的推廣、應用。

發明內容

本發明目的在于，針對目前嗜酸乳桿菌發酵生產中所存在的，或效果雖好但生產成本過高，或雖成本不高但其發酵水平太低，達不到飼料工業應用效果等缺陷，提供一種以價格低廉、材料易得的農副產品為原料，輔以合理的發酵工藝，達到提高發酵水平、降低生產成本的生產飼用嗜酸乳桿菌的方法。

本發明目的通過以下技術方案得以實現。

固、液二步發酵工藝生產飼用嗜酸乳桿菌的方法，該方法按以下步驟進行：

(1)解脂假絲酵母(Yarrowia?lipolytica)的菌種培養：

①液體試管種子培養：采用10°Bx糖化麥芽汁為培養基，121℃、20分鐘滅菌后，接入解脂假絲酵母原始斜面菌種，28～30℃靜止培養24～30h后，于0～4℃保存，備用；

②三角瓶種子培養：500ml的三角瓶中裝由麩皮、玉米粉和磷酸氫二銨按重量份70～90∶20～30∶0.5～1比例配制而成的培養基20～30g，加水量為固形物重量的1～1.5倍，經0.1Mpa滅菌30min后，每瓶接種步驟(1)①液體試管種子2ml，28～30℃培養36～42h后，于0～4℃保存，備用；

(2)解脂假絲酵母的固體發酵培養：

固體發酵培養基為豆粕、麩皮、玉米粉和磷酸氫二銨按重量份30～60∶30～60∶10～30∶0.5～1比例配制而成，加與固形物同等重量水，0.1Mpa滅菌30min；將步驟(1)②每三角瓶種子加150～300ml無菌水充分攪拌后，按每瓶種子：以固形物重量計的10～20公斤固體發酵培養基比例接種，于25～30℃室溫條件下進行曲盤固體發酵，發酵物料厚度為2-3cm，培養24～30h，至細胞數達到每克干物質60億時停止發酵，將發酵物65℃下烘干、粉碎、儲存，備用；

(3)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus?acidophilus)的菌種培養：

①一級菌種培養：在300ml三角瓶中裝入200ml液體MRS培養基，121℃、15分鐘滅菌后接入嗜酸乳桿菌原種斜面菌種，經37～40℃培養30～36h后，于0～4℃保存，備用；

②二級菌種培養：取步驟(2)干粉狀的解脂假絲酵母固體發酵培養物和葡萄糖及水按6～10∶1～4∶100的比例，拌勻、調漿后，加熱至85～100℃，保持5min滅菌；冷卻至40℃，按發酵體積2～3％的用量接入步驟(3)①一級菌種，于37～40℃靜止培養8～10h時攪拌一次，再繼續培養4～6h至嗜酸乳桿菌活菌數達50億CFU/ml以上時終止培養，室溫保存，備用；

(4)嗜酸乳桿菌的液體發酵培養：

取步驟(2)干粉狀的解脂假絲酵母固體發酵培養物和葡萄糖及水按6～10∶1～4∶100的比例，拌勻、調漿后，加熱至85～100℃，保持5min滅菌；培養液冷卻到40℃，按發酵體積3～5％的用量接入步驟(3)②二級菌種子，于37～40℃靜止培養6～8h時攪拌一次，再繼續培養6～8h至嗜酸乳桿菌活菌數達55～80億CFU/ml時發酵結束；

(5)嗜酸乳桿菌發酵液的吸附處理與包裝：